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APRESENTAO

Local do trabalho: Laboratrio de Engenharia Bioqumica


UFCG/CCT/UAEQ
Motivao

Objetivos

Reviso bibliogrfica

Materiais e mtodos

Resultados e discusso

Concluses
MOTIVAO
Processos biotecnolgicos (enzimas): o mercado
brasileiro essencialmente importador em termos de
produo e uso das enzimas no pas

Pectinases: 25% das vendas globais (alimentcias)

Aplicaes:

amadurecimento de frutas;
clarificao e reduo de viscosidade em sucos de
frutas;
tratamento do suco de uva;
extrao de polpa de tomate;
tratamento de resduos vegetais;
degomagem de fibras (indstria txtil e de papel);
extrao de leos vegetais;

Produo: Fermentao (fungos do gnero Aspergillus e
Penicillium)

Substrato: resduo do umbu

MOTIVAO
Concentrao e purificao: Processos de custo elevado

SABs: Rendimentos elevados em tempos curtos e com
custos baixos

Caracterizao das enzimas: Labilidade
OBJETIVOS
o Objetivo Geral
Caracterizar a exo-poligalacturonase, produzida por
fermentao semisslida da casca do umbu e concentrada em
SABs, quanto a estabilidade frente a variao do pH e
temperatura e condies de temperaturas e pHs timos do
extrato enzimtico bruto e das fases PEG e sal dos SABs para
o substrato utilizado (cido poligalacturnico).
OBJETIVOS
o Objetivos especficos
Caracterizar a farinha da casca do umbu;

produzir a enzima exo-poligalacturonase por meio da
fermentao semisslida da casca do umbu;

obter o extrato enzimtico bruto, produzido pela
fermentao semisslida;

concentrar as enzimas pectinases em SABs do Tipo PEG-
SAL, nas condies operacionais adequadas;

caracterizar os SABs;

caracterizar as enzimas obtidas quanto ao pH timo e
temperatura tima no extrato bruto e no SABs;

determinar a estabilidade da enzima no extrato bruto e nos
SABs frente a variaes de pH e temperatura.

REVISO BIBLIOGRFICA
o Umbu

Tpica da regio semirida do Brasil.

Aproveitamento total da planta.

Produo de 9.268 toneladas (IBGE).

Perodo de safra rpida com abundncia de frutos (28 e
32 mil frutos por planta, algo em torno de 350 quilos
safra/ano).

Independente da irregularidade da chuva

Grande perda por falta de infraestrutura e tecnologias de
processamento.
REVISO BIBLIOGRFICA
o Pectina

Polissacardeos constitudo na maioria por cidos D-
galacturnicos unidos por ligaes o1,4 no qual, pelo
menos 75 % dos grupos carboxila do cido galacturnico
so esterificados com metanol.

Confere: rigidez
parede celular quando
est ligado celulose.













cido
galacturnico
c. galacturnico
metilesterificado
Figura 1 - Estrutura da molcula de pectina
REVISO BIBLIOGRFICA
o Pectina

Ligao 1,4 so hidrolisados em meios cidos originando
monossacardeos e em meios bsicos desmetoxilada.

Utilizadas como agentes geleificantes e fibras funcionais.















REVISO BIBLIOGRFICA
o Pectinases
Enzimas que reconhecem ligaes entre unidades de
cidos galacturnicos.
Produzidas por vegetais e micro-organismos
Utilizadas pelas indstrias de processamento de frutas
Constitudas por um complexo multienzimtico.
Classificao:
Pectinaesterase,
Protopectinases,
Despolimerizantes (hidrolticas e as liases): catalisam a
clivagem das ligaes glicosdicas das substncias
pcticas
Hidrolticas: poligalacturonases e as polimetilgalacturonases





REVISO BIBLIOGRFICA
o Pectinases (POLIGALACTURONASES)

Ativadas em pHs 4,0-6,0 e temperaturas de30-40C.

Endo-PG: hidrolisam as ligaes glicosdicas (14)
internas de forma randmica.

Exo-PG: removem as molculas de cido D-galacturnico
pela hidrlise das ligaes glicosdicas (14) a partir da
extremidade






exo-PG
endo-PG
Figura 2 - Forma de atuao das exo-PG e endo- PG
REVISO BIBLIOGRFICA
o Produo de Pectinases (FSS)

Bactrias, fungos e leveduras

Fungos Filamentosos

Mais adaptveis ao meio

Alta atividade

Atividade tima em faixa de pH baixa

Fermentao semi-slida (FSS):

Ausncia de gua livre

Slido natural como substrato ou suporte inerte

Possibilidade de usar resduos agroindustriais
(matrias-primas: 60% a 80% do custo final)

Alta produtividade

Alta concentrao dos produtos






Figura 3 - Aspergillus niger
REVISO BIBLIOGRFICA
o SABs (downstream processing)

Extrao com solvente

Utilizao:

Extratos impuros
Extratos concentrados
Enzimas purificadas

Processo de recuperao de bioprodutos

SABs so adequados para recuperao e concentrao

No agressivo (65 a 90% gua)
Alto grau de purificao e rendimento
Processamento contnuo
Baixo custo

Composto por polmero de alto peso molecular e soluo
concentrada de sal liotrpico ou dois polmeros solveis em
gua

As biomolculas tendem a se distribuir entre as fases
conforme a afinidade.










Figura 4: SAB
REVISO BIBLIOGRFICA
o Caracterizao da enzima

Enzimas so protenas eu atuam com catalizadores de
reaes bioqumicas

Desnaturao: alterao sensvel na estrutura original da
protena

Fatores que causam a desnaturao das protenas:

pH;
temperatura;
agentes caotrpicos.

Condies industriais




Figura 5 modo de ao enzimtica da
PG em uma molcula de pectina
REVISO BIBLIOGRFICA
o Caracterizao da enzima

Estudo da Arte

Zheng e Shetty (2000)

Efeito do pH e temperatura na estabilidade da PG
produzida por Lentinus edodes usando resduos de frutas
como substrato. A PG mostrou estabilidade em uma faixa de
temperatura de 50C a 85C, apresentando cerca de 90% de
atividade e uma faixa de pH de 3,5 a 6,5.

Martins et al. (2005)

Efeito do pH e temperatura na estabilidade da PG
produzida por fermentao submersa, utilizando Termoascus
aurantiacus. A PG mostrou estabilidade abaixo de 50C,
apresentando 80% da atividade e na faixa de pH de 3,0 a 3,5,
apresentando 91% de atividade.




MATERIAIS E MTODOS
o Matria-Prima
Casca do umbu (Spondias tuberosa).
Figura 6 Cascas do umbu
MATERIAIS E MTODOS
o Preparao da Farinha da Casca do Umbu (Resduo Seco)

Aquisio dos
umbus
Higienizao
Descascamento
Secagem
Moagem
MATERIAIS E MTODOS
o Caracterizao Fsico-Qumica do Resduo Seco
Granulometria
Densidade aparente (
a
)
Densidade real (
r
)
Porosidade
pH
Teor de umidade
Cinzas
Slidos solveis totais (Brix)
Acares redutores
Acares totais
Pectina
Protena Bruta

MATERIAIS E MTODOS
o Processo fermentativo
Preparao do
substrato
Esterilizao
Inoculao
Incubao
Extrao
MATERIAIS E MTODOS
o Preparao do substrato
Fonte de Nitrognio: 1,5% (NH
4
)
2
SO
4
Umidade: 60%
o Esterilizao
Presso: 1 atm

Tempo: 15 min
o Inoculao
Inculo: 10
7
esporos/g de meio
o Incubao
Tempo: 44 horas
Temperatura: 30
o
C
MATERIAIS E MTODOS
o Extrao
Solvente: tampo acetato de sdio 200 mM, pH
4,5 / gua
Razo solvente/massa: 10ml/g de amostra
Tempo: 45 min
Temperatura: 30
o
C
Agitao: 150rpm

MATERIAIS E MTODOS
o Atividade exo-poligalacturonase nas condies padro
Extrato
Enzimtico
Soluo de cido
Poligalacturnico
(0,25% m/v)
Absorbncia
DNS
35C
30min
pH4,5
Banho
maria por
5 min
MATERIAIS E MTODOS
o Atividade exo-poligalacturonase nas condies padro
Procedimento: COURI (1993), seguindo a adaptao da
Embrapa Agroindstria Tropical Fortaleza/CE.


( )
.17.2.
212,16.
a b
meiofermentado
Abs Abs f
U
APG RE
g t
| |

=
|
|
\ .
MATERIAIS E MTODOS
o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs
Preparao do SAB (PEG 8000/fosfato de potssio)

72% de extrato enzimtico
12% de fosfato de potssio
16% de PEG

Coleta
das
fases
PEG
SAL
MATERIAIS E MTODOS
o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs
Caracterizao das fases
Volume
Densidade
Massa
Atividade
Enzimtica
Teor de
Protena
MATERIAIS E MTODOS
o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs
Determinao dos coeficientes de partio (Kp e Ke).

Avaliao do processo de concentrao da exo-
poligalacturonase.
MATERIAIS E MTODOS
o Caracterizao da Exo-poligalacturonase
Estabilidade Frente a temperatura (30-90C)
Estabilidade Frente ao pH (2,5-9,8)
Temperatura tima (30-90C)
pH timo (2,5-9,8)
R
R
P
A
AT
A
=
RESULTADOS E DISCUSSO
Parmetros analisados
Valor
Umidade b.s. (%)
8,47 0,10
Cinzas (%)
3,93 0,08
Protena total (%)
1,81 0,04
Pectina (%)
14,95 1,20
Acares Totais (%)
9,16 0,54
Acares Redutores (%)
8,85 0,08
Slidos solveis totais (Brix)
36,00 0,00
pH
1,84 0,04
Densidade aparente (a)(g/mL)
0,53 0,01
Densidade real (r)(g/mL)
1,57 0,00
Porosidade do leito
0,66
o Caracterizao fsico-qumica dos resduos secos
Tabela 1 - Valores mdios e desvios padro dos parmetros fsico-
qumicos do resduo seco da casca do umbu.
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao fsico-qumica dos resduos secos
Figura 7 - Distribuio granulomtrica do resduo seco da casca do
umbu
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 2 - Recuperao da exo-poligalacturonase nas fases PEG
e sal dos SABs

Recuperao
da enzima
SABs com extrato bruto
lixiviado com tampo
acetato
SABs com extrato
bruto lixiviado com
gua
Rs (%) 39,86 38,14
Ri (%) 70,57 72,05
o Recuperao e concentrao da exo-poligalacturonase
SAB contendo o extrato enzimtico lixiviado com tampo
acetato:

Ke = 0,53

SAB contendo o extrato enzimtico lixiviado com gua:

Ke = 0,49
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato
enzimtico bruto
Figura 8 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG
produzida por FSS.
Temperatura tima
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato
enzimtico bruto
Figura 9 - Termoestabilidade da exo-PG produzida por FSS.
Estabilidade Frente a temperatura
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato
enzimtico bruto
Figura 10 - Efeito do pH na atividade da exo-PG produzida por
FSS.
pH timo
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato
enzimtico bruto
Figura 11 Estabilidade da exo-PG produzida por FSS frente ao
pH.
Estabilidade Frente ao pH
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 12 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG
concentrada na fase PEG.
Temperatura tima da exo-PG na fase PEG
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 13 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG
frente a temperatura.
Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente a
temperatura
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 14 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG
concentrada na fase sal.
Temperatura tima da exo-PG na fase sal
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 15 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal
frente a temperatura.
Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente a
temperatura
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 16 Efeito do pH na atividade da exo-PG concentrada na
fase PEG.
pH timo da exo-PG na fase PEG
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 17 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG
frente ao pH.
Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente ao
pH
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 18 Efeito do pH na atividade da exo-PG concentrada na
fase sal.
pH timo da exo-PG na fase sal
RESULTADOS E DISCUSSO
o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB
Figura 19 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal
frente ao pH.
Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente ao
pH
CONCLUSES
O Resduo da casca do umbu promissor para obteno de
poligalacturonases.

A estabilidade da exo-PG no extrato enzimtico bruto na
faixa de (30 a 60C) com mxima atividade residual de 83%
na temperatura de 30C.

A estabilidade da exo-PG no extrato enzimtico bruto na
faixa de pH cido (2,5-5,6) com atividades residuais em
torno de 90%.

A temperatura tima foi da exo-PG no extrato enzimtico
bruto foi a 40C, apresentando 100% da atividade residual

O pH timo foi da exo-PG no extrato enzimtico bruto foi
2,5, apresentando 60% da atividade residual.

A expo-PG presente no extrato enzimtico bruto apresentou
uma partio em torno de 70% para a fase inferior, rica em
sal.


.
CONCLUSES
A estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG
apresentou os melhores resultados na faixa de (30-50C),
sendo a mxima atividade residual encontrada (85,3%) na
temperatura de 50C.

A estabilidade da exo-PG concentrada na fase Sal
apresentou os melhores resultados na faixa de (30-60C),
sendo a mxima atividade residual (60%) obtida nas
temperaturas de 40C e 60C.

A estabilidade frente as variaes de pH da exo-PG
concentrada na fase PEG apresentou os melhores
resultados na faixa de pH cido (2,5-5,6), sendo a melhor
atividade residual (81%) obtida no pH 2,5.

A estabilidade frente as variaes de pH na fase sal
apresentou os melhores resultados na faixa de pH (3,5-7,5)
com valores em torno de 92,42%.

CONCLUSES
A temperatura tima da exo-PG na fase PEG foi de 30C e
40C e o pH timo foi 5,6, apresentando atividade residual
de 36% e 56% respectivamente.

A temperatura tima da exo-PG na fase sal foi de 30C e o
pH 3,6, apresentando atividade residual de 79% e 85%
respectivamente.

A exo-poligalacturonase produzidade por o Aspergillus niger
CCT 0916 uma enzima mesoflica e cida.

Aps ser concentrada em SABs, a exo-poligalacturonase
apresenta uma maior resistncia trmica, passando a tolerar
temperaturas levemente mais altas.

AGRADECIMENTOS
PALOMA LIMA: palomalima_eq@yahoo.com
LBIA CONRADO: libiaconrado@yahoo.com.br