Biotecnologa Vegetal

Cultivo in vitro
Ingeniera gentica
Marcadores moleculares
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Cultivo in vitro
Partes de plantas y plantas enteras en medios
aspticos y ambientes controlados (luz y T)

Totipotencialidad vegetal: capacidad de
clulas vegetales (no todas) de regenerar
plantas enteras.

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Cultivo in vitro

- Cultivo de anteras: doble haploides
BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Cultivo in vitro

- Poliploides: Protoplastos
Biotecnologa de hibridacin somtica
(fusin de protoplastos y regeneracin
de plantas enteras).
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Cultivo in vitro

- Poliploides: inhibicin de huso mittico
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Plantas transgnicas:

Genes forneos se pueden transferir, integrar y
expresar en plantas usando Agrobacterium
tumefasciens como vehculo o mediante biobalstica.

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Plantas transgnicas:

Vectores de transformacin: plasmidos con
informacin esencial para replicarse, transferirse,
integrarse y posibilitar expresin de genes forneos
en genoma de la cel vegetal.
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Plantas transgnicas:

Resistencia a plagas y enfermedades
Resistencia a condiciones ambientales extremas
Las plantas como bio-fbricas
Mejora de la calidad en productos agrarios
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Cultivos Bt resistentes a los insectos

Las esporas de BT contienen una protena cristalina
(Cry). En el intestino del insecto, la protena se
descompone y libera una toxina que se une al
revestimiento intestinal y crea poros as muere el
insecto.

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Tolerancia a los herbicidas
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Las plantas como bio-fbricas:
Las plantas son fuente de alimento, combustible, y
fibras.


BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EL TOMATE DE LARGA VIDA
En tomates, la enzima poligalacturonasa degrada
las pectinas (componentes esenciales de muchas
frutas)
Consecuencia: reblandecimiento del fruto y
deterioros en su aroma y sabor.
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EL TOMATE DE LARGA VIDA
Procedimiento:
1 Las plantas transgnicas de tomate se
transforman en la regin codificadora del gen de la
enzima poligalacturonasa.
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EL TOMATE DE LARGA VIDA
Procedimiento:
2 El gen se ha insertado al revs en el mdulo de
expresin, es decir, en antisentido.

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EL TOMATE DE LARGA VIDA
Procedimiento:
*Antisentido: en la doble cadena de DNA:
- la guanina se sustituye por citosina y la
citosina por guanina.
- la adenina se sustituye por timina y la timina
por adenina.

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EL TOMATE DE LARGA VIDA
Procedimiento:
3 El gen en antisentido transcribe un mRNA con
secuencia complementaria al mRNA transcrito por
el gen de la poligalacturonasa endgena: formacin
de RNA de doble hebra lo cual impide su
traduccin, reprimiendo la expresin del gen e
inhibiendo el ablandamiento del fruto

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Marcadores Moleculares
Tipos de Marcadores Genticos
Tipos Nivel de Anlisis
Morfolgicos Fenotipo

Bioqumico Producto gnico

Molecular Secuencia de ADN
Lisis celular
Remocin de protenas
Precipitacin
Extraccin de ADN
ADN PCR, SECUENCIACIN, ETC.
Enzimas de restriccin

Tijeras Moleculares

Cortes en sitios palndromes



PCR:

Polymerase chain reaction

Amplificar un fragmento de ADN

PCR: componentes

Taq DNA polimerasa (Thermus aquaticus)
Templado: DNA vegetal
Primers: fragmentos especficos para un gen
o una secuencia, aprox 20 nucletidos
dNTPs: desoxirribonucletidos
Mg++
Buffer
PCR: fases

Denaturacin
Annealing
Extensin
Electroforesis

Separacin de fragmentos de DNA
Geles de agarosa o poliacrilamida
Los fragmentos se movilizan por una
diferencia de potencial elctrico
Los fragmentos se pueden extraer del gen
para secuenciarlos
Secuenciacin
Mtodo terminacin de cadena o mtodo
didesoxi de Sanger

Secuenciacin automtica mediante
fluorforos
Marcadores moleculares:
Funcionan en base a la
variabilidad de la secuencia de ADN
ATTCGCTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCGTTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCGCTATCGAA- - -TACGCTGCGAACGGG
ATTCGCTATCGAACGCCGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCG - - - CGAACGCTACGCTGCTATCGAACGGG
Sustitucin
Delecin
Repeticin
Transposicin
RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)
Marcador dominante (presencia ausencia)
Utiliza partidores universales al azar (10pb)
Permite amplificar fragmentos entre 200-2000pb
Permite amplificar varios loci al mismo tiempo
Polimorfismo de
secuencia en el
sitio del partidor
Especmen 1 Especmen 2
Utilidad:
- Cartografa gentica
- Hibridacin
- Estructura gentica de poblaciones
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
Matriz de datos es llevada a
PROGRAMAS
AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
Permite detectar una
gran cantidad de
marcadores de ADN
polimrficos.
Involucra una digestin
con enzimas de
restriccin y dos rondas
de PCR
Permite detectar
presencia-ausencia de
fragmentos de restriccin.
ADN
1) Digestion con enzimas de
restriccin (EcoRI, MseI)
C G T A A C C
G C A T T G G
C A A T T C C
G T T A A G G
2) Ligacin de adaptadores
AATTC
G
T
AAT TTAA
Adaptador EcoR I
TA
Adaptador Mse I
Genera fragmentos de ADN entre 100-1500pb
3) PCR preselectivo
Fragmentos de ADN
con adaptadores
AATTCN
GN
NT
NAAT
TTAA
TA
Primer 1 5 --------- + A EcoR I
C --------- 5 Primer Mse I
4) PCR selectivo con
partidores fluorescentes
Primer 3 5 --------- + AAC
AATTCA GTTA
CAAT
TTAAGT
AAC --------- 5 Primer Mse I
AATTCAAAC GTTGTTA
AACCAAT
TTAAGTTTG
Corrida electrofortica en gel de poliacrilamida
bajo condiciones denaturantes
Fuentes de polimorfismo: Prdida de sitios de restriccin
In-dels
Microsatelites
Secuencias simples repetidas en el genoma, sin funcin codificante,
extremadamente variables
Tambin conocidos como SSR (Simple Sequence Repeats)
SSR Mononucleotdica (A)
11
ctgttgAAAAAAAAAAAtgagag
SSR Dinucleotdica (GT)
6
ccaagtGTGTGTGTGTGTtgaat
SSR Trinucleotdica (CTG)
4
cagagtCTGCTGCTGCTGgtaat
SSR Tetranucleotdica (ACTC)
4
actgtACTCACTCACTCACTCtgaat

Homocigoto:
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG (CT)
7
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG (CT)
7

Heterocigoto:
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG (CT)
7
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG (CT)
9
Microsatelites (SSR)
Aplicaciones
Estudios de pedigree
Estudios en gentica de poblaciones
Diagnstico e identificacin de enfermedades
Seleccin asistida
Seleccin asistida

Distancia gentica y Ligamiento


Seleccin asistida

Distancia gentica y Ligamiento

Recordar la 2 ley de mendel:
Segregacin independiente


Para que exista 25% de gametos de cada clase,
cada par de alelos (cada locus) debe estar en
cromosomas distintos, as segregarn
independientemente


Si la prueba de chi cuadrado dice
que no hay herencia Mendeliana?

Es decir que no se puede validar
estadsticamente la proporcin
fenotpica 9:3:3:1

Ser que no se cumple la ley de
segregacin independiente de
caracteres?

Pero qu pasara si los loci que determinan ambos
caracteres estuvieran en el mismo cromosoma?


Recordar el concepto de recombinacin


Pregunta: qu es mas probable, que haya
recombinacin (crossing over) entre los loci A y B o
entre los loci B y C?


Aqu surgen los conceptos de ligamiento de genes
y distancia gentica
Comparar con el cruzamiento de prueba
de un dihibridismo mendeliano

(Segregacin independiente, loci en cromosomas distintos)

Fenotipo doble dominante: RrYy

Parental doble homocigoto recesivo: rryy

ry
ry ry ry
RY RrYy RrYy RrYy RrYy
Ry Rryy Rryy Rryy Rryy
rY rrYy rrYy rrYy rrYy
ry rryy rryy rryy rryy
25% de cada clase fenotpica
Mientras ms prximos estn los loci, menos
probable ser la recombinacin entre ellos y, por lo
tanto, menos individuos recombinantes habrn.
La frecuencia de recombinacin (el porcentaje de
recombinantes sobre el total) se utiliza como medida
de la distancia gentica.

Lo anterior, dio origen a la unidad de distancia
gentica, la cual se denomina centimorgan (cM) y se
utiliza para hacer mapeo gentico.


Seleccin asistida

Genes de efecto mayor
fenotipos difciles de evaluar
Ej juvenilidad arbreas
QTLs
Quantitative trait loci
Caracteres cuantitativos

http://www.knowledgebank.irri.org/ricebreedingcourse/image106.gif