FUNDAMENTO DE LA

REACCION EN CADENA DE
LA POLIMERASA
(PCR)





JULIO 2013.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica que ha
revolucionado el modo de manipular, clonar y detectar fragmentos de
ADN, lo que le ha valido a su descubridor K. B. Mullis (1983)

Esta herramienta que permite obtener (amplificar) secuencias
(regiones) especficas del ADN (genes) a partir de un genoma,
plsmido, fragmentos, produciendo un gran numero de copias.

*Clonacin acelular (clonacin de molculas de ADN o ARN sin la
intervencin una clula).

Aplicaciones:
Clonacin de ADN
Deteccin de secuencias sin purificar
Bsqueda de mutaciones
Diagnstico de enfermedades
Estudios evolutivos y filogenticos
Secuenciacin
Primeros ciclos obtenemos:
-fragmentos largos
-fragmentos cortos
Fragmentos de la secuencia
buscada hasta el 3er ciclo.
Equipo:
Termociclador
A una concentracin aprox 50 200 ng / ml
-DNA genmico, DNA plsmidico, RNA (para
obtener cDNA), Otros
1)Molcula molde.
2) Nucletidos
dNTPs (Adenina, Guanina, Timina, Citosina)
Concentracin molar especifica
3) Enzima (DNApol)
Taq Polimerasa (Vent, Biorad, etc.)
Buffer de la enzima
Cofactores (Mg
+2
)
4) Oligonucleotidos
(primers o cebadores)
Secuencias de DNA de longitud especifica
( min 8 nt max 30 nt)
*Forward o Sentido (5 - 3)
*Reverse o Anti sentido ( 3 - 5)
5)Condiciones de Amplificacin.
Ciclos de replicacin ( 30 40 ciclos)
Tres condiciones especificas :
Desnaturalizacin, Hibridacin y Elongacin.
Requerimientos para el PCR
CONDICIONES DE AMPLIFICACION.

Un ciclo de amplificacin de PCR consta de tres etapas principales:

A) Desnaturalizacin
Separacin de las 2 hebras de DNA
-Temperaturas 68-97C
-Tiempo 30 -120seg (2-5 minutos)

B)Hibridacin o Templado
-Alineamiento de oligos con su secuencias diana
-Temperaturas 37-65C
-Tiempo 10- 120seg (2 minutos)

C)Elongacin
-Accin de la DNApolimerasa
-Temperaturas 72-75C
-Tiempo 1-3minutos

Elongacin final max 10 minutos

Mantenimiento 4C

T (C)

100

90

80

70

60

50

D- Desnaturalizacin T- Templado E- Elongacin
D D D
T
T
E
E
M
1 ciclo (5min)
Ciclos
5 min
Ciclo 30
Aprox. 2-3hrs
Ejemplo de Mezcla de Reaccin para PCR.
DNA (50-200ng/ml) 1 ml
dNTPs 8 ml
Oligonucleotidos 2 ml ( 1 ml de cada uno)
BufferThermopol 5 ml
Enzima Vent 1 ml
H2O 33 ml
Vf 50 ml

Nota:
La cantidad de enzima puede variar dependiendo de las U/ml
El volumen de reaccin puede variar segn el usuario.

Ejemplo de condiciones PCR.

Desnaturalizacin 95C 1 ciclo 00: 05: 00

Alineamiento 95C 00 : 00 : 45
68C 30 ciclos 00 : 00: 45
72C 00 : 01: 30

Polimerizacin 72C 1 ciclo 00: 10 : 00
Parmetros en la amplificacin por PCR

*El diseo de los oligonucletidos cebadores (oligos o primers).

*Dmeros de oligonucletidos que pueden competir con la amplificacin del
producto deseado.
*Pegado inespecfico
*Hibridacin entre oligos


Las principales variables a tener en cuenta son:

1.Tamao del oligonucletido
2.Temperatura de fusin (Tm, Ta)
3.Especificidad
4.Secuencias complementarias
5.Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) or polipurinas (A, G)
6.Secuencia 3 terminal.
7.Secuencia 5 terminal y regiones centrales

1.Tamao del oligonucletido
-8 a 30 nt (optimo de aprox 20 nt)
-Limites de acuerdo a la Tm

2.Temperatura de fusin (Tm , melting temperature) (Formula de Wallace)
-Para cada oligonucletido

Tm = 2(A+T) + 4 (G+C)
Tm, temperatura media a la cual la mitad del DNA se encuentra disociado e indica
hibridacin.
Las temperaturas de ambos oligos deben ser iguales o tener una diferencia de entre
2 5 C.


OTRAS CONSIDERACIONES.
-Tm producto amplificado
Tm(C)=81.5+16.6(log[K+])+1.4(%G+C)-(675/n)

-Ta temperatura de amplificacin.
Ta=0.3(Tm)+0.7(Tm prod amp)-14.9

Tm menor queTa

Tamao
del Oligonucletido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)

Tamao
del Oligonucletido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)
4 12C 22 66C
6 18C 24 72C
8 24C 26 78C
10 30C 28 84C
12 36C 30 90C
14 42C 32 96C
16 48C 34 102C
18 54C 36 108C
20 60C 38 114C
TIPOS DE PCR
Se han diseado PCR ms especficas que se pueden elegir segn
sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, adems de
la bsica, son:

PCR anidada

PCR mltiple

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR).

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa.

PCR in situ

PCR especficos: RAPD, RFLP, ISSR.