MTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA

CELULAR

I - MICROSCOPIAS
M
I
C
R
O
S
C
O
P
I
A
S
Incio (1600):
- Incorporao do microscpio aos estudos anatmicos;
- Desenvolvimento de tcnicas de preparo para a visualizao
dos materiais biolgicos
1663
Robert Hooke
1852 1750
1689
Marcello
Malpighi
Marcello Malpighi
(1628-1694)
(1689)
Nossa opinio que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena,
interna de uma vscera, que foi exaltada nestes tempos, de uso
a nenhum mdico
Mdicos: Rejeitaram microscopia intil
Descries sobre os capilares eram falsas
Anatomia comparada era irrelevante para medicina
Anatomia humana s era til para descrio
Introduo da microscopia medicina

Estudo de capilares
Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que so colocadas de
forma a ampliarem a imagem do objeto
Interao da luz
com o espcime
Absoro
Refrao dos
raios de luz
ou
Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve
Na formao da imagem aos Microscpios, dois
fenmenos devem ser considerados: a absoro e a refrao
Interao da luz
com o espcime
Microscpio
produo de imagens aumentadas de
objetos no visualizados olho n
Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia
1) De luz (ML) / ptico (comum)
Modificado (variaes) com propsitos especiais
Contraste de fase Invertido
Polarizao Fluorescncia

2) Eletrnico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de eltrons
Microscpio eletrnico de transmisso (MET)
Microscpio eletrnico de varredura (MEV)
Fonte luminosa luz branca
(lmpada com filamento de
tungstnio)

ptica lentes
ampliao
condensao
Mecnica

Sistema de iluminao
Microscpio de luz
comum / campo claro
Componentes:
Os modelos microscpicos variam na forma e no desenho
Princpios da formao da imagem ao Microscpio
Fonte
de luz
condensadora
objetiva
ocular
objeto
Imagem
I
Imagem II
F
F F
C
C C
O posicionamento estratgico das lentes no microscpio proporcionam
a formao de uma imagem Invertida
Fonte de luz Lente condensadora Lentes objetivas Lente ocular
Trajeto da luz
Centralizao do feixe de luz
Iluminao de Khler
Iluminao perfeita
Menos ocorrncia de
aberraes e irregularidades
no trajeto luminoso
Objetiva (s) = prxima ao objeto
Corrige aberraes = qualidade da imagem
Tipos: acromtica, semi-apocromtica, apocromtica, planacromtica, planapocromtica
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imerso)
Projeta imagem real e invertida
Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva
Aumentos: 10x, 12x
Aumento final
4x = Vermelha
10x = Amarela
40x = Azul claro
100x = Preta / branca
Objetiva
AN = Abertura numrica
n = ndice de refrao do meio de montagem
sen = Fornecido pelo fabricante da lente
A = ngulo de abertura da objetiva
= ngulo correspondente metade de A
AN = 0,12 (4x)
AN = 0,34 (10x)
AN = 0,60 (40x)
AN = acima de 1 (100x)
AN = n.sen
Abertura Numrica
100X
40X
10X
4X
Bom microscpio:
1) Poder de Resoluo (PR): Capacidade de uma lente (ou do prprio
microscpio) em formar imagens com detalhes mnimos
2) Limite de Resoluo (LR): Menor distncia entre 2 pontos
distintos do objeto, que podero ser individualizados na imagem
final
> PR < LR
Poder de Resoluo X Limite de Resoluo
ou
Quanto melhor for a capacidade de
individualizar 2 pontos distintos do objeto
(< LR) maior ser a definio da imagem
formada no aparelho ( > PR)
Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscpio
Planos de cortes
Imagem microscpio = bidimensional
Objeto de estudo = tridimensional
Planos de cortes
Leia a etiqueta da lmina material / corte / colorao
Examine a lmina macroscopicamente pode-se obter muita
informao
Objetiva de menor aumento (panormica)
Ajustar rea a ser observada, centralizando-a na platina
Iluminao de Kehler
Objetivas de aumentos maiores
Sequncia de passos
Observao: imagem invertida
Microscopia de Luz
Microscopia convencional
Microscopia de contraste de fase
Microscopia de contraste interferencial
Microscopia de campo escuro
Microscopia de polarizao
Microscopia de fluorescncia
Microscopia confocal a laser
Microscopia eletrnica
Microscopia eletrnica de
transmisso
Microscopia eletrnica de alta
voltagem
Microscopia eletrnica de
varredura
Outros tipos de microscpio
Microscopia de tunelamento quntico
Microscopia de fora atmica
Tipos de Microscpios
Princpios da Difrao da Luz
Anis metlicos colocados no caminho da
luz (Zernik, 1950)
Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase)
Retardo ptico
e
Refrao da luz
Microscopia de Contraste de fase
Microscopia de Contraste de fase
1 Anel
2 Anel
Anlise do material biolgico sem colorao prvia:

1. Culturas de clulas
2. Exames parasitolgicos
3. Esfregaos e Raspagens de mucosas (Consultrios)
4. Sangue
5. Protozorios de ambientes aquticos
6. Algas
7. Bactrias
Diferenas de ndices
de refrao

Sem colorao
Bactrias
Cultura de clulas: neurnios
Aplicaes da Microscopia de Contraste de fase
Esfregao de Sangue
Diviso Celular em Raiz de
Cebola
Aplicaes da Microscopia de Contraste de fase
Anlise do material com colorao prvia
Prismas pticos posicionados no caminho da luz
Microscopia de Contraste Interferencial
Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Contraste com o meio em que se encontra o material a ser
analisado
Microscopia de Contraste Interferencial
Defasagem dos comprimentos de onda
Microscopia de Normarski
Microscopia de Contraste Interferencial
Gera uma deformao na imagem
Permite contraste interferencial
Aumentando o relevo das
superfcies do material analisado
Princpio
Observao de materiais biolgicos sem colorao:

1. Parasitologia: Interpretao de estruturas e apndices dos parasitos
(taxonomia)
2. Anlise de massa seca celular organizao e compactao de material
biolgico
3. Monitoramento de culturas celulares
Algas
Escamas
Aplicaes da Microscopia de Contraste Interferencial
Cultura Celular: macrfago caro
Aplicaes da Microscopia de Contraste Interferencial
2 Filtros ou Prismas:
1 Polarizador Entre a fonte de luz e o condensador
2 Analisador Entre a objetiva e a ocular
Promovem a seleo de apenas um plano de direo de vibrao das
ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP)

Observao:
Microscopia de luz comum feixe de ondas luminosas direo de
vibrao em todos os planos
Microscopia de Polarizao
Filtros:
2
1
Microscopia de Polarizao
PLP
Anisotropias pticas
Fenmenos de ordem espectral
Dicrosmo
(1 filtro polarizador)
Birrefringncia
(2 filtros polarizadores
cruzados perpendiculares)
Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e
rotacionados a 90
o
permitem a distino de macromolculas ditas
anisotrpicas (birrefingentes ou dicricas)

Microscopia de Polarizao
Birrefringncia
ocorre
Componentes macromoleculares
Birrefringentes:

Anisotrpicos (brilho colorido ou no)
Cruzamos perpendicularmente os 2
filtros (polarizador e analisador)
Material realado
Outros componentes
No refringentes:

Isotrpicos Indistintos em fundo escuro
1. Anlise de macromolculas que apresentam graus ordenados de
agregao: DNA, colgenos fibrilares, celulose, tubulina
2. Anlise de clulas que apresentem organizao interna de suas
macromolculas altamente cristalinas: clula muscular esqueltica,
espermatozides (ordem molecular)
3. Anlise de tecidos biolgicos com ordem molecular nos arranjos
macromoleculares: tecidos sseos, cartilagens, dente
4. Anlise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Aplicaes da Microscopia de Polarizao
Tecido sseo
Gros de Amido
Aplicaes da Microscopia de Polarizao
Mesentrio de rato. Colorao: Picro-sirius
(fibras de colgeno: intensa birrefringncia /
brilhante / amarelo)
Microscopia de Luz Polarizada
Birrefringncia
pode ser
intensificada
por corantes
Exemplos:

Colgeno
- Xylidine Ponceau
- Picro-sirius

Cromatina / Matriz Extracelular
- Azul de toluidina
(ordem e agregao molecular )

Tecido sseo: osso esponjoso /
fibras colgenas
Tecido sseo : sistema de Havers ou
steon / fibras colgenas
Colorao: Picro-sirius / Luz polarizada
Aplicaes da Microscopia de Polarizao
Birrefringncia dependendo do grau de agregao de cristalinidade
A observao e a medida das propriedades anisotrpicas (dicrosmo e
birrefringncia)
a) Diagnstico de patologias
Materiais biolgicos podem apresentar:
b) Estabelecimento ordem molecular
Fases da vida celular
Importantes para:
Os microscpios de campo
escuro apresentam um tipo especial
de condensador - inclina a luz de
tal modo que ela no atravessa o
objeto

A luz se dispersa

Apenas os feixes desviados pelo
objeto percorrem o resto do sistema
(objetivas e oculares)

Microscopia de Campo Escuro
empregada para estudos de pequenos
materiais:
Plncton
Bactrias
Cristais
Estruturas subcelulares
(fimbrias e flagelos)
Gros de plen
Microscopia de campo escuro
da bactria Leptospira spp
Aplicaes da Microscopia de Campo Escuro
Propriedade fsica de
algumas substncias
absorverem a luz, em um
determinado
comprimento de onda, e
emitirem luz com
comprimentos de onda
maiores e nveis
energticos mais baixos
Microscopia de Fluorescncia
Microscopia de fluorescncia
mostrando uma clula embrionria de
Caenorhabditis elegans em diviso
Baseia-se na:
Fluorescncia natural:
Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente
fluorescentes
Clorofila
Lignina de parede vegetal
Elastina
Colgeno
A fluorescncia visvel neste nudibranqueo
dupla: os pigmentos verdes prprios da lesma
e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)
Outros componentes:
Se ligam a substncias fluorescentes fluorocromos emitem
brilho contra fundo escuro
Alaranjado de acridina
(fluorocromo)
Clulas do testculo de
triatomneos (barbeiro)
Diviso celular
RNA - vermelho DNA - verde
1. Sistema ptico interage com pouca luz:
Luz de mercrio de alta presso
2. Sistemas de filtros requeridos para detectar o brilho do material
contra o fundo negro (a. Filtro de excitao; b. Filtro de barragem)
Fonte de luz Ftons
Filtro de excitao (seleciona
os ftons de determinado
comprimento) Objeto
Emite luz fluorescente
Filtro de barragem (luz de
excitao bloqueada)
Imagem observada (formada
pela luz que atravessa o
filtro de barragem)
b. Filtro de barragem
Ocular
a. Filtro de excitao
Fonte
de luz
Objetiva
Microscopia de Fluorescncia
Microscopia de Fluorescncia
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao
desenvolvimento de vrios corantes (fluorocromos)
muitas so as utilizaes da microscopia e fluorescncia
Fluorocromos:
Alaranjado de acridina
Eosina
DAPI
Rodamina
Fluoresceina
Emitem brilho contra
fundo escuro
Aplicaes da Microscopia de Fluorescncia
Aplicaes da Microscopia de Fluorescncia

Quantificao (Fluorometria): citoqumica normal e patolgica

Imunofluorescncia: conjugao de anticorpos a fluorocomos
que permite identificao de molculas especficas

Imunocitoqumica

Hibridao in situ (FISH)

Identificao de compostos naturalmente fluorescentes
Aplicaes da Microscopia de Fluorescncia
Princpios da formao da imagem ao Microscpio
Com colorao
fluorescente
Sem
colorao
Com
colorao
Diferenas
de ndices
de refrao
Cores de
interferncia
Campo
escuro
1987 - Disponvel mundialmente

O microscpio confocal tem seu
funcionamento baseado nos princpios da
microscopia de fluorescncia Utiliza laser
como fonte de luz

Permite a visualizao: materiais
espessos; corpos inteiros sem colorao
prvia (vivos ou pr-fixados)

Reconstruo do objeto
tridimensionalmente Vrios planos
focais ou cortes pticos (programas
computacionais)
Microscopia confocal a laser
Aplicaes da Microscopia confocal a laser
1. Todas as possibilidades j descritas para a microscopia de
fluorescncia convencional

2. Reconstruo 3-D de organismos microscpicos

3. Aumento de sinais de fluorescncia de estruturas subcelulares. Exs:
microtbulos, miofilamentos, filamentos intermedirios e elementos
finos da matriz extracelular

Clulas em apoptose:
condrcitos
Clulas em prfase
Aplicaes da Microscopia confocal a laser
Protozorio
Macrfago
Aplicaes da Microscopia confocal a laser
Gros de Plen
Diviso celular / Fuso mittico
Aplicaes da Microscopia confocal a laser
Incio:

Estudos do comportamento ondulatrio dos eltrons
Semelhantes a ftons
num sistema de vcuo
Primeiros experimentos:

Dcada de 1920 Busch
(eltrons conduzidos por lentes eletromagnticas)

1931 Ruska Primeiro M.E. Poder de
resoluo: 0,5 nm 25 mil vezes a capacidade do
olho humano

Microscopia eletrnica
Ernst August
Friedrich Ruska
(1906-1988)
Principais
diferenas
Fonte Luz
(poro inferior)
Eltrons
(poro superior)
Lentes Vidro Eletromagnticas
Lentes de aumento
(principal)
Objetivas e oculares Eletromagnticas
Suporte para
amostra
Lmina de vidro Grade de metal
(telinha)Cobre ou nquel
Limite de
resoluo
0,2 0,0002
Formao da
imagem
Transparncia e colorao Variaes de densidade e
contrastao
Microscpio eletrnico
de transmisso (MET)
Microscpio de luz (ML)
Microscopia de Luz e Microscopia Eletrnica
Questes importantes: Ampliao e Resoluo
Microscopia eletrnica
O avano da microscopia eletrnica se deu a partir da descoberta de que
os eltrons tinham comportamento ondulatrio semelhante aos ftons de
luz
Microscpio Eletrnico de
Transmisso (MET)
Microscpio Eletrnico de
Varredura (MEV)
Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) e
de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET)
Microscpio eletrnico
de transmisso (MET)
Microscpio eletrnico
de varredura(MEV)
Formao da imagem ao Microscpio eletrnico:
Fonte de eltrons Caminha por um sistema de lentes eletromagnticas
(coluna) Feixe de eltrons Acelerados Lente condensadora
Amostra Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra)
Lentes intermediarias / projetivas (formao final da imagem) Imagem
ampliada Anteparo fluorescente / monitor
Fixao
(glutaraldedo / tetrxido)

Desidratao

Incluso (resinas)

Cortes

Contrastao com
metais pesados

Principais etapas da preparao das amostras para MET
Eletrodensa (escura) os eltrons encontram elementos como: ferro,
smio, chumbo, ouro etc
Eletrolcida (clara) os eltrons encontram elementos como:
hidrognio, carbono, oxignio, nitrognio etc
Observao:
Contrastao do material biolgico (maioria eletrolcidos):
metais pesados
Imagem final ao MET
Colorao negativa:
vrus
Tecido muscular
Heptcito:
Complexo de Golgi
Clio
Clulas epiteliais
Microscopia Eletrnica de Transmisso
Revela feies topogrficas da superfcie (detalhes)
Imagens tridimensionais:
- Vermes
- Insetos
- Clulas livres (animais/vegetais)
- Embries
- Fragmentos geolgicos
Eltrons secundrios / refletidos na superfcie da amostra
Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
Guelras de
um peixe
Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
Preparao das amostras
Fixao (glutaraldedo / tetrxido de smio)

Desidratao

Secagem (ponto crtico)

Evaporao com ouro na
superfcie a ser analisada

No necessita de contrastao
Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
Title: An Army of One"
Category: Photo Microscopy
Photographer: Freder Medina
Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
Descrio de estruturas subcelulares ()
Ex.: Citoesqueleto

Aparelho grande: equivalente a um edifcio de trs andares
- Alta acelerao eletrnica (500 a 1.000 KV)
- Permite estudos de corte grossos
- Reconstruo tridimensional

Microscopia Eletrnica de Alta Voltagem ou Alta Acelerao
Dcada de 1980
Potncia visual do olho humano:
1 milho de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atmica
Benning / Rohrer (1986): Prmio Nobel de Fsica
Princpio: todos os corpos:
- Caractersticas ondulatrias
- Emisso de energia
Microscopia de Tunelamento Quntico
Agulha que dista da superfcie da amostra em 1 (1 milionsimo de mm)
Agulha: percorre a superfcie da amostra corrente eltrica (tunelamento)
Corrente atrai eltrons do material para a agulha tunel
Agulha passa sobre um tomo corrente
Agulha percorre os espaos entre os tomos corrente
Esses sinais ( e ) so transmitidos para o computador imagens
superfcie de vales e montanhas
Microscopia de Tunelamento Quntico
1 milho de Vezes (100x a capacidade do MET)
=
ESTRUTURA ATMICA

Molcula de miosina
Cromossomos
Microscopia de Tunelamento Quntico
semelhante ao Microscpio de Tunelamento Quntico
Diferena:
- Presena de microespelho
- Feixe de laser sobre a agulha
Menor agressividade amostra
Deteco de detalhes de superfcie

Aplicaes:
- Obteno de imagens em soluo
- Sequncias de reaes qumicas ou modificaes estruturais ao
longo do tempo
- Estrutura atmica de biomolculas
Microscopia de Fora Atmica
Microscopia de Fora Atmica
Imagem de uma plaqueta
obtida por microscopia de
fora atmica
Imagem de eritrcitos
obtida por microscopia
de fora atmica
Brasileiro ganha prmio internacional para imagens de
microscopia de fora atmica
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edio do Prmio
Internacional de Imagens de Microscopia de Fora Atmica.
A imagem de autoria do
pesquisador da Embrapa,
que mostra a superfcie das
clulas vermelhas do sangue
depois do tratamento com
peptdeos antibiticos, foi a
nica imagem no europia
premiada dentre as mais de
250 inscritas. O prmio visa
o reconhecimento da
importncia das imagens de
microscopia para os avanos
da nanotecnologia em todo
o mundo.
Reportagem publicada no dia 10/09/2007
Title: Formosa Nano-Rose"
Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen
Vencedor do Science as Art Contest de 2008
Scanning electron Microscopy imagem representa um
nico cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado
Fim