UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

LABORATRIO DE PATOLOGIA CLNICA

APLICAO DO MTODO ELISA NA QUANTIFICAO

DE CALPROTECTINA EM PACIENTES COM DOENA
INFLAMATRIA INTESTINAL (DII)
Marcelo Salvatte Pinheiro

DII

Um grupo de condies inflamatrias do clon e intestino

delgado. Os principais tipos de DII so doena de Crohn
(CD) e colite ulcerativa (UC).

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Caracterstica

UC

DC

Histrico do paciente
Condio de fumante

No fumante ou ex-fumante

Fumante

Sintomas

Sangramento retal, clicas

Diarreia, dor abdominal, perda de peso,

nusea, vmitos

Sinais

Achados perianais normais, ausncia de

massa abdominal

Marcas cutneas perianais, fstulas, abscessos;

massa abdominal; baqueteamento digital

Endoscopia

Envolvimento retal; inflamao superficial

contnua, com mucosa frivel e granular;
leo terminal normal ou mostrando ilete por
contracorrente

Preservao retal; ulcerao local com mucosa

interferente normal; lceras aftosas, lineares ou
estreladas; leo terminal inflamado
apresentando lceras aftosas ou lineares

Histologia

Inflamao superficial, contnua e difusa;

deformao da arquitetura crptica

Inflamao focal, lceras aftosas, agregados

linfoides, inflamao transmural, granulomas
(15 a 30% dos pacientes)

Sorologia

Nveis elevados de p-ANCA (60 a 80% dos

Nveis elevados de ASCA
pacientes)

Exames fsicos

Exames laboratoriais

ASCA = anticorpo anti-Saccharomyces cerevisiae;

p-ANCA = anticorpo anticitoplasma de neutrfilo.

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Sistema imune intestinal em pessoas saudveis:

- Juno aderente (zonula adherens) e juno
apertada (tight junction) intactas;
- No reconhecimento de micro-organismos
comensais como patognicos;

- Equilbrio entre resposta imune e regulao.

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Sistema imune intestinal em pessoas com DII:

- Juno aderente (zonula adherens) e juno

apertada (tight junction) frouxas;
- Clulas dendrticas reconhecem microorganismos comensais como patognicos;
- Aumento da resposta imune e
diminuio/supresso da regulao.

Sndrome do intestino irritvel (SII):

No existem leses responsveis pelo aparecimento da
sndrome;
Diagnstico: interpretao dos sintomas relatados ao mdico;
exames complementares;
Sintomas: Dores e inchao abdominais; flatulncia; muco nas
fezes; diarreia ou priso de ventre durante um perodo
prolongado.
Diagnstico diferencial: colonoscopia com bipsia das leses
patolgicas.

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CALPROTECTINA
- Calprotectina (tambm conhecida como
MRP-8/14, calgranulina A/B ou S100A8/A9)
uma protena ligadora de clcio e zinco
da famlia de protenas S100;
- Produzida nos neutrfilos e moncitos;
- Concentrao em neutrfilos: 5-15 mg/L
(cerca de 60% das protenas citoslicas
solveis).
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CALPROTECTINA
Funes:
- Proteo contra proteases leucocitrias e bacterianas;
- Efeito antibacteriano;
- Propriedades reguladoras intra e extra-celulares em
processos inflamatrios.

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ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoadsorvente
Ligado Enzima)

Baseia-se na quantificao de uma reao enzimtica

associada com complexos imunes;
Objetivo: deteco e quantificao de determinado antgeno
ou anticorpo em uma amostra.
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ELISA
Direto (ou Sanduche):

Indireto:

Detecta ANTGENO;

Detecta ANTICORPO;

Placa revestida com anticorpo

especfico;

Placa revestida com antgeno

especfico;

Segundo anticorpo ligado uma

enzima (fosfatase alcalina,
peroxidase, B-galactosidase);

Segundo anticorpo ligado uma

enzima e especfico para o
anticorpo que se quer quantificar;

Adio de substrato cromforo e

posterior leitura da Densidade
ptica (OD) em espectrofotmetro.

Adio de substrato cromforo e

posterior leitura da Densidade
ptica (OD) em espectrofotmetro.

ELISA
Direto (ou Sanduche):
Deteco do ANTGENO.

Indireto:
Deteco do ANTICORPO.

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ELISA
Direto (ou Sanduche):

Indireto:

Dosagem de hormnios,
marcadores tumorais, protenas
sricas, antgenos virais e de outros
patgenos;

Diagnstico de doenas infectocontagiosas onde a deteco de

anticorpos IgG, IgA ou IgE seja

Amostras: plasma, soro, fezes, urina,

secrees.

IgM (?).

significativa (Chagas, HIV);

CALPROTECTINA = DIRETO
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APLICAO
Concentrao de calprotectina nas fezes: correlao com
parmetros histolgicos e endoscpicos de atividade da doena
em pacientes com DII;

Diferenciao confivel entre DII e SII;

Deteco precoce da recorrncia de inflamaes no intestino;

Avaliao da severidade de uma inflamao para controle da

evoluo e terapia.
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AMOSTRAS
Fezes coletadas em recipiente apropriado, sem adio de
conservantes;

Estabilidade das amostras:

- 6 dias sob refrigerao (2-8C);
- Aps o processamento inicial (extrao) as amostras so
estveis 7 dias sob refrigerao (2-8C) e 24 meses -20C.

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PROCEDIMENTOS
Tubo Coletor

Pressione a amostra sobre

a cavidade da base,
nivelando com a borda

Pressione o tubo
firmemente sobre a base e
remova a aba

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PROCEDIMENTOS

Abra a tampa superior

e pipete 4 mL do Buffer
de Extrao

Feche o tubo e
homogeneze por 1 min
utilizando um Vortex

Transfira o
homogeneizado para
um Eppendorf de 2 mL
e centrifuge por 5 min
3000 rpm

1. Armazene o extrato conforme indicado;

2. Dilua 1:50 com o Buffer de Incubao para o intervalo de 10 600 g/g; ou
3. Dilua 1:150 com o Buffer de Incubao para o intervalo de 30 1800 g/g.
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PROCEDIMENTOS
LAVAGEM (2X)

INCUBAO
(30 min, 18-28oC, 450 rpm)

LAVAGEM (5X)

100 mL CALIBRADORES,
CONTROLES E AMOSTRAS

100 mL ENZIMA
CONJUGADA

100 mL H2O2 + TMB

LEITURA OD 450 nm

INCUBAO
(30 min, 18-28oC, 450 rpm)

LAVAGEM (3X)

INCUBAO
(15 min, 18-28oC, 450 rpm)

100 mL H2SO4 0,25 M

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PROCEDIMENTOS
SUGESTO DE LAYOUT:
CAL1 CAL1
CAL2 CAL2
CAL3 CAL3
CAL4 CAL4
CAL5 CAL5
C1

C1

C2

C2

AMOSTRAS EM
DUPLICATA

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CARACTERSTICAS
Significado clnico dos resultados:
Valores abaixo de 50 g/g:
No so indicativos de inflamao no trato gastrointestinal;

Valores entre 50 e 200 g/g:

Podem representar uma moderada inflamao devida ao uso de antiinflamatrios no esteroidais (AINEs), moderada diverticulite, ou DII em
remisso;
Valores acima de 200 g/g:
Doena ativa com inflamao presente.
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CARACTERSTICAS
Intervalo curto: 10 600 g/g
Calibradores: 10, 30, 100, 300 and 600 g/g
Diluio final das amostras: 1:2500
Intervalo extendido: 30 1800 g/g
Calibradores: 30, 90, 300, 900 and 1800 g/g

Diluio final das amostras: 1:7500

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JUSTIFICATIVA

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INOVAO

Quantum Blue Calprotectin

Quantum Blue Reader

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OBRIGADO