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ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

EEL / USP

Disciplina: Engenharia Bioqumica II A


Programa de Aperfeioamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro
Prof Arnaldo Mrcio

Etapas de um Processo de Purificao

Etapa do processo

Clarificao

Rompimento de clulas

Operaes unitrias

Princpio

Filtrao convencional
Centrifugao
Filtrao tangencial (membranas)

Tamanho de partculas
Tamanho e densidade de partculas
Tamanho de partculas

Floculao

Hidrofobicidade de partculas

H omegeneizao
Ultra-som
Moagem em moinho de bolas

Cisalhamento
Cisalhamento
Cisalhamento
Hidrlise, solubilizao ou desidratao de
molculas que compem a parede ou a
membrana celular
Solubilidade
Massa molar e raio hidrodinmico de
molculas

Rompimento qumico ou enzimtico


Precipitao

Purificao de baixa resoluo

U Itrafiltrao (membranas)

Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar


Cromatografia de troca-inica
Cromatografia de afinidade (biolgica ou
qumica)
Cromatografia de imunoafinidade

Purificao de alta resoluo


Cromatografia de interao hidrofbica
Cromatografia de excluso molecular
Membranas adsortivas
Cristalizao

Tratamentos finais

Tipo e densidade de carga na superfcie da


biomolcula
Stios especficos da superfcie de uma
protena (adsoro)
Stios especficos da superfcie de uma
protena (adsoro antgeno/anticorpo)
Hidrofobicidade
Massa molar
Massa molar e caractersticas para adsoro
ou stios especficos da superfcie de uma
protena
Solubilidade e caractersticas de equilbrio
lquido-slido

Liofi I izao

Caractersticas de equilbrio lquido-slido

Secagem

Caractersticas de equilbrio lquido-slido

Rompimento Celular
Rompimento
Celular
Clarificao

Suspenso
Celular

Produtos
Intracelulares
Produtos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil

em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do rompimento

Aplicados aps a separao e lavagem das clulas;


Clulas animais (possuem apenas membrana), fcil

rompimento com baixa fora de cisalhamento;


Ex.: Clulas animais: rompidas por simples variao da

presso osmtica do meio, adio de detergentes ou


aplicao de ultra-som de baixa intensidade

Forma mais adequada de


Rompimento?
Tipo de microrganismo
Tamanho da clula;
Tolerncia a tenses de cisalhamento;
Necessidade de controle de temperatura;
Gasto de energia;

Parede Celular

Mtodos de Rompimento Celular


Mecnicos

Homogeneizador de alta presso


Moinho de bolas
Ultrassom

Nomecnicos

Choque osmtico
Congelamento-descongelamento
Aquecimento
Secagem

Qumicos

lcalis
Solventes
Detergentes
cidos

Enzimticos

Lize enzimtica

Homogeneizador a alta presso

Cavitao
Turbulncia
Cisalhamento

Mecnico - Homogeneizador a
alta presso
Este tipo de rompimento provoca aumento da

temperatura do meio, por isso necessita de sistema de


refrigerao
Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi,

velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s


e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa
mida).

Mecnico - Homogeneizador a alta presso


O desempenho pode ser afetado por:

Presso de operao;
Velocidade de alimentao;
Temperatura;
Estado fisiolgico do microrganismo;
Condies de cultivo;
Tipo de clula e sua concentrao.

tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)

presso (maior => maior eficincia)


nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-

dimento)

Existe um modelo matemtico para avaliar o


rompimento, que neste caso de 1a ordem em
relao ao nmero de passagens e de potncia
em relao presso de trabalho:

log

Rm
=
(Rm R)

k . N . Pa

onde:

Rm a concentrao mxima de protena


disponvel para ser liberada (g/L)
R a concentrao de proteina liberada (g/L)
k a constante de velocidade que depende de T,
X e do tipo de clula
N o nmero de passagens
P a presso
a constante que depende do tipo de
microrganismo e das condies de crescimento
(varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

Mecnico Moinho de Bolas


Consiste na passagem da suspenso celular por uma

cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida


de um eixo com discos de agitao e preenchida com
esferas de vidro.
O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento

aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular


das clulas.

Mecnico Moinho de Bolas

Mecnico Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras

(~20kHz), so convertidas em vibraes em um


meio lquido e causam o fenmeno de cavitao.
Escala de laboratrio.

Mecnico - Ultrassom

Rompimentos Mecnicos
Desvantagens:
As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelos

rompimentos mecnicos podem destruir organelas


celulares e desnaturar enzimas;
Com o rompimento integral das clulas todo o contedo

intracelular, incluindo cidos nuclicos, organelas e


fragmentos celulares liberado junto com a molcula-alvo,
sendo que o homogeneizado celular pode conter grande
quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.