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Aminocidos, peptdeos e

protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Caractersticas qumicas
dos aminocidos
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Os aminocidos

Os aminocidos
presentes nas
protenas so
ismeros L

Carbo
no alfa

A biologia canhota

Glicina no
tem isomeria
ptica

Grupo R apolar e
alifticos
Aminocidos apolares e hidrofbicos
Ligaes de Van der Waals
Ala, Val, Leu, Iso
Interaes hidrofbicas

Gly; menor aminocido


Met
Possui tomo de enxofre

Pro
Iminocido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromticos
Aminocidos hidrofbicos
Tirosina pode formar pontes de
hidrognio com a gua
Modificaes pstraducionais
Fosforilao do OH
da tirosina

Fenilalanina
Mais apolar

Grupos R polares, no
carregados
Solubilidade intermediria em gua
Serina e treonina
Grupos hidroxil

Asparagina e glutamina
Grupo amida

Cistena
Grupo sulfidril
Ligaes dissulfeto

Grupos R carregados
Aminocidos bsicos

Carga positiva
Lisina, segundo grupo amino
Arginina, grupo guanidina
Histidina, grupo aromtico
imidazol

Aminocidos cidos
Carga negativa
Possuem segundo grupo
cido carboxlico

Aminocidos
incomuns
Modificaes ps-traducionais

4-hidroxiprolina
5-hidroxilisina
6-N-metil-lisina
Gama-carboxiglutamato
Fosforilao de resduos

Selenocistena
Selnio ao invs de enxofre na Cys
adicionado durante a traduo por
mecanismo especfico e regulado

pH e pKa
Constantes de dissociao
dependem do pH do meio e so
diferentes para diferentes molculas
Ionizao
< pH; > [H]+
estado no-ionizado

Aminocidos so
ionizveis
Substncias
anfteras:
possuem natureza
dual
Podem funcionar
assim como
cidos ou bases
Doam ou recebem
prtons

Titulao de um
aminocidos
pKa: tendncia de um
grupo fornecer um
prton ao meio
Aminocidos podem
perder at 2 prtons
para o meio
Concluso: a funo
das protenas depende
do pH ao qual esto
submetidas

Curvas de titulao
predizem a carga eltrica
dos aminocidos
Alguns aminocidos podem ter tomos
ionizveis tambm em sua cadeia lateral

Peptdeos e protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Polipeptdeo
>Insulina [Homo sapiens]
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN
QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA
LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY
CN

Peptdeos tbm so
ionizveis
Ou seja,
possuem curva
de titulao
caracterstica
Funcionam em
faixas de pH
timas

Nmero de resduos por


protena

Uso de
aminocidos
Varia bastante entre
as protenas
No permite predizer
com preciso o
comportamento
molecular da
molcula

Protenas com outros grupos


qumicos
Adicionados ps-traducionalmente

Trabalhando com
protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Protenas podem ser


separadas e purificadas
Sabendo que a clula possui
milhares de protenas, como
purificar uma nica delas?
Basta selecionar por propriedade
Tamanho, carga e propriedades de
ligao

Obter o extrato bruto


correr em cromatografia de coluna
Fase estvel (matriz)
Fase mvel (soluo com tampo)

Coluna maior permite maior


resoluo na separao

Cromatografia por troca


inica
Polmero carregado
negativamente
Protenas positivas ligam
ao polmero e demoram
mais a ser eludas da
coluna

Afinidade da protena
definido tambm pelo
pH

Cromatografia por excluso


de tamanho
Grnulos porosos
na matriz seguram
as molculas
menores
Molculas grandes
no entram nos
poros e so
eludas primeiro

Cromatografia de
afinidade
Adiciona-se matriz
da coluna algum tipo
de molcula
ligante da molcula
de interesse
Molcula ligadora de
ATP; adiciona-se ATP
matriz
Elui-se com soluo
de ATP

Eletroforese -Histrico

1952, Markham and Smith

1955, Smithies

Gis de acrilamida com maior resoluo e


permitem separar ainda molculas
grandes de DNA

1980, Schwartz and Cantor

Gis de amido funcionam bem para


separar protenas do soro humano

1967, Loening

Ao estudarem hidrlise de RNA percebem


que molculas de diferentes estruturas
tm sua mobilidade diferenciada quando
aplicadas num papel e submetidas a um
campo eltrico

Eletroforese em campo pulsado separa


fragmentos enormes

hoje impossvel imaginar um


laboratrio de biomol sem eletroforese
acontecendo a todo instante...

Vou ali
correr um
gelzinho e
j volto

Tenho que ir
seno vou perder
meu gel

Eletroforese
Movimento de partculas
dispersas num fludo sob
influncia de um campo eltrico
uniforme
DNA, carga negativa
Tem tendncia a se dirigir ao
polo positivo quando sujeito a
um campo eltrico

Serve para separar molculas


por tamanho/carga eltrica
Protena deve ser desnaturada
com detergente (SDS)

Tcnica utilizada exausto em


trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas
1.Preparao do gel
2.Aplicao das amostras
3.Eletroforese
4.Colorao
5. Anlise dos resultados

Preparao
do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida

Aplicao das amostras

Definio do mapa
das amostras por
canaleta

Corrida do gel
Aplicao do campo
eltrico
Fonte eltrica gera
fluxo de ons atravs
da soluo tampo
Terminais positivo e
negativo
Tempo adequado,
seno o DNA sai do gel

Colorao das molculas


Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

Melhor resoluo

Coomassie blue, etc


Brometo de etdio
Agente intercalante do DNA
Cancergeno!

Composto fluorescente luz UV


Gel de agarose

Eletroforese de um
resultado de cromatografia

O marcador de peso
molecular
Comprado de uma empresa
Possui protenas de peso molecular bem conhecido

Permite saber o peso molecular da(s) protena(s)


presente(s) numa amostra

Geis
bidimensionais
Corre-se o gel normalmente
em uma dimenso... E
depois vira-se-o e corre-se
em outra dimenso
Cada ponto representa
aproximadamente uma
protena original presente na
amostra
Maiores gis do maiores
resoluo

Protenas no separadas
podem ser quantificadas
Deve-se saber
qual o substrato
que a enzima
usa
Deve-se poder
medir o produto
da ao
enzimtica
Uma unidade
de enzima
digere 1mol de
substrato por
minuto a 25C

Estrutura primria das


protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Nveis estruturais das


protenas

As estruturas
primrias das
protenas so
conhecidas

Para todos os genomas


sequenciados, conhece-se
a estrutura primria de
todas as protenas para
este organismo
As pontes dissulfeto
podem se formar entre
diferentes cadeias proticas
E principalmente dentro da
mesma

Sequenciamento de
peptdeos
Degradao de Edman
Marca e remove apenas o
resduo N-terminal

Mtodo ineficiente,
permite sequenciamento de
pequenas pores das
molculas
Sequenciamento do RNAm
muito mais simples e
preciso; permite sequenciar
protenas enormes como a
titina

Produo de peptdeos
Purificao a
partir de tecidos
Engenharia
gentica
Sntese qumica
direta

Alinhamento de
sequncias
Os organismos
possuem, em grande
medida, as mesmas
protenas (ortlogas)
Derivam do ancestral
comum entre os
organismos

O alinhamento permite
que identifiquemos as
pores mais
importantes
(conservadas) da
protena

Evoluo molecular
Quanto mais similares as
sequncias das protenas dos
organismos, mais prximos eles so
evolutivamente

rvore molecular da vida

Concluses
Diferentes caractersticas qumicas das cadeias laterais
dos aminocidos definem caractersticas de peptdeos e
protenas
Os resduos de aminocidos so ligados s centenas
ou milhares para formar peptdeos e protenas
As protenas podem ser modificadas pstraducionalmente
As protenas podem ser separadas por carga, tamanho e
afinidade e assim estudadas isoladamente
cromatografia e eletroforese
As protenas podem ser sequenciadas e sua estrutura
primria (seq. de aminocidos conhecida)
As sequncias das protenas so excelentes marcadores
da evoluo da vida na terra