CROMATOGRAFIA

LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION
(HPLC)

FUNDAMENTO
El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla
basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias
analizadas y la columna cromatografca. en esta tcnica la fase mvil es un
liquido y se utilizan altas presiones.

CLASIFICACION

Cromatografa de reparto: En este tipo de cromatografa la fase

estacionaria es un liquido inmovilizado sobre un material inerte solido
que solo acta de soporte, se utiliza para separar especies poco polares
pero no inicas.

Cromatografa de adsorcin (L-S):la fase estacionaria solida retiene

a los solutos por un doble efecto de adsorcin fsica y qumica, las
interacciones implicadas son del tipo de fuerzas de Van der Waals y
sirve para separar especies no polares, ismeros estructurales e
hidrocarburos alifticos.

Cromatografa inica: el solido retiene a los solutos gracias a

atracciones electrostticas. La fase estacionaria solida lleva en la
superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles
que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil; sirve para
separar especies inicas de masa molecular inferior a 10000.

Cromatografa de exclusin por tamao: la fase estacionaria es un

material poroso que retiene a las molculas en funcin de su tamao;
sirve para separar solutos con pesos moleculares superiores a 10000

INSTRUMENTACION

Eluyentes
Sistema de impulsin
Sistema de inyeccin de muestra
Columna
Detector
Sistema de control y adquisicin de datos

APLICACIONES: RPC

PURIFICACION DE PEPTIDOS Y PROTEINAS DE ORIGEN NATURAL

la RPC no es un mtodo tan apropiado para separar pptidos y protenas de fuentes

biolgicas debido a la presencia de lpidos y otros solutos altamente hidrofobicos
que se unen fuertemente a la fase estacionaria, dificultando su separacin de la
columna.
En primer lugar, si una protena o pptido se va a utilizar en estudios funcionales,
debemos asegurarnos que la actividad biolgica se mantiene despus de cada paso
de purificacin. Este no es un problema critico cuando se trata de pptidos o
protenas pequeas, pero las protenas grandes tienden a desnaturalizarse bajo las
condiciones de la RPC la presencia de proteasas en las muestras puede dificultar la
purificacin de polipeptidos.
Una manera de evitar la degradacin de protenas es adicionando a la solucin
amortiguadora inhibidores especficos de proteasas.

Purificacin de pptidos y protenas recombinantes:

las protenas o pptidos secretados al medio son relativamente fciles de
purificar y en general, no son susceptibles a las proteasas intracelulares. La
purificacin de pptidos recombinantes del medio extracelular puede dificultarse
por los volmenes tan grandes que se obtienen por lo que se requiere de un
paso inicial para concentrar la muestra.
Este inconveniente se puede resolver si se une al pptido una secuencia terminal
especifica como protena A, glutatin trasferasa, o poli aminocidos, lo que
permitir una purificacin cromatografica por afinidad. Una vez concentrado y
purificado el pptido ser necesario remover el asa a travs de mtodos
enzimticos o qumicos.

Purificacin de pptidos obtenidos por digestiones enzimticas: La

digestin de una protena con proteasas, usualmente tripsina, genera una
mezcla de pptidos que pueden ser separados por RPC para obtener un mapa
peptdico de la protena.
Incluso puede asignarse la posicin de los puentes de disulfuro al comparar los
cromatogramas de una digestin en donde los puentes de disulfuro
permanezcan intactos y los cromatogramas de otra digestin en donde los
puentes de disulfuro hayan sido reducidos con -mercaptoetanol.
Purificacin de pptidos sintticos: La generacin de pptidos sintticos
genera contaminantes adyacentes como pptidos truncados o con
modificaciones en la secuencia de aminocidos. Tambin se encuentran
presentes pequeas molculas orgnicas como fenol y tioles, producidos al
separar el pptido sinttico de la fase estacionaria o soporte.
Los pptidos con menos de 20 aminocidos, en general, se pueden obtener con
un alto grado de pureza usando solamente RPC. Para purificar microgramos de
muestra podra utilizarse un empaque con partculas de 5 m, pero si se
requieren cantidades mayores ser necesario utilizar una matriz de 15 a 30 m.

DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS PRESENTES

EN LA PASTA POR HPLC

Para realizar la metdica de determinacin de azucares por HPLC se utilizo pasta

kraft cruda de Eucalyptus globulus.

Pasadas las muestras patrn de los monosacridos, se obtuvieron aprox los

siguientes tiempos de retencin (min): GLC(11,10), XYL(12,15), GAL(13.45),
ARA(14,78), MAN(14,72); y los tiempos de retencin de los reactivos utilizados
fueron: TFA(7,53),H2SO4 (12,6), inositol (19,72)

SEPARACION DE LAS CLASES DE LIPIDOS NEUTROS DE

POLEN APICOLA POR HPLC

Separacin de las diferentes clases de lpidos neutros del polen apcola en

condiciones isocraticas, con deteccin UV a 206 nm e inyeccin directa de la
muestra en columna de silica.
Como fase mvil se uso n-hexano-2-propanol acido actico (100: 0,5: 0,1. se
aislaron 3 fracciones de lpidos neutros en las 35 muestras analizadas: esteres
de esteroles, carotenoides, ceras, triglicridos y cidos grasos