CULTURA CELULAR

Biologia Celular e Molecular - 1 ano

2004/2005

Orientadora: Prof Doutora Delminda Neves

Diana Gonalves; Filipa Fernandes; Hugo Oliveira; Ilidia Carmesim; Liliana Teixeira

ndice

O que ?
Histria
Classificao
Heterocarion
Hibridoma
Linhagem de clulas
Preparao
Vantagens
Desvantagens
Limitaes
Exemplo
Referncias
Agradecimentos

O que ?
Conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas
isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as
caractersticas prprias;
- Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos,
animais e vegetais;
A cultura de tecidos implica a prvia desagregao (mecnica
ou enzimtica) do tecido original e em que as clulas so
cultivadas numa camada aderente, num substrato slido ou em
suspenso em meio de cultura.

Factos marcantes no desenvolvimento

da cultura de tecidos e cultura de clulas
1885 ROUX clulas embrionrias de pinto podem ser mantidas
vivas em soluo salina (fora do corpo do animal.
1907HARRISON controvrsia da neurobiologia ,cada fibra
nervosa produto de uma nica clula nervosa e no a fuso de
muitas.
1910 ROUS induz um tumor usando um extracto filtrado de
clulas de tumor de galinha, mostrando mais tarde conter um
vrus de RNA (vrus de sarcoma de Rous).
1913 CARREL clulas podem crescer por perodos longos em
cultura, desde que sejam alimentadas regularmente, sob
condies asspticas.
1948 EARLE isola um nica clula da linhagem das clulas L e
mostra que elas formam clones de clulas em cultura de tecidos.
1952 GEY linhagem contnua de clulas derivadas de um
carcinoma cervical humano, que mais tarde se tornou bastante
conhecida como linhagem de clulas HeLa.

Factos marcantes no desenvolvimento da

cultura de tecidos e cultura de clulas
1954 LEVI-MONTALCINI factor de crescimento do nervo (NGF)
estimula o crescimento dos axnios em cultura de tecidos.
1956 PUCK seleccionou mutantes com requerimentos de
crescimento, alterados a partir de cultura de clulas HeLa.
1958 TEMIN e RUBIN ensaio quantitativo para infeco de
clulas de pinto em cultura, purificando o vrus do sarcoma de
Rous.
1961 HAYFLICK e MOORHEAD fibroblastos humanos morrem
aps um nmero finito de divises em cultura.
1964 LITTLEFIELD meio HAT para o crescimento selectivo de
clulas somticas hbridas. Juntamente com a tcnica de fuso
das clulas, tornando acessvel a gentica de clulas somticas.
KATO e TAKEUCHI planta completa de cenoura, em cultura de
tecidos, a partir de uma nica clula da raiz da cenoura.

Factos marcantes no desenvolvimento da

cultura de tecidos e cultura de clulas
1965 HAM meio definido, sem soro, capaz de suportar o
crescimento clonal de certas clulas de mamferos.
HARRIS E WATKINS primeiros heterocarions de clulas de
mamferos,pela fuso de clulas humanas e de camundongo,
induzida por vrus.
1968 AUGUSTI-TOCCO e SATO adaptam um tumor de clula
nervosa de camundongo (neuroblastoma) cultura de tecidos
e isolam clones que so electricamente excitveis e que
estendem os prolongamentos nervosos.
1975 KOHLER e MILSTEIN 1 linhagem de clulas de
hibridoma secretoras de anticorpos monoclonais.
1976 SATO 1 srie de trabalhos mostrando que diferentes
linhagens de clulas necessitavam de diferentes misturas de
hormonas e de factores de crescimento para crescerem em
meio sem soro.

Factos marcantes no desenvolvimento da

cultura de tecidos e cultura de clulas

1977 WIGLER e AXEL mtodo eficiente para introduzir genes

de cpia nica de mamferos em clulas cultivadas, adaptando
um mtodo anterior desenvolvido por Graham e Van der EB.
1986 MARTIN e EVANS isolam e cultivam clulas
embrionrias totipotenciais do rato estaminais.
1998 TOMSON e GEARHART isolam clulas embrionrias
humano.

Histria
Primeiras culturas foram feitas a partir de fragmentos de
tecidos colocados em cogulos de plasma.
Grande avano (1940):
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crescimento de linhagens celulares a partir de clulas
isoladas que aderiam superfcie de placas de cultura
Mas
As clulas eram cultivadas em meios
combinao de soro e extractos embrionrios.

indefinidos:

Histria
Em 1952:
Crescimento de clulas num meio contendo:
- Plasma de galinha
- Extracto de embrio bovino
- Soro de cordo umbilical

Mas
O meio era complexo e indefinido tornando impossvel analisar
as necessidades especficas para o crescimento de clulas
animais.

Histria
HARRY EAGLE

Fig.1- Harry Eagle

Realizou uma anlise sistemtica dos nutrientes necessrios ao

crescimento de clulas animais em cultura;
Estudou o crescimento de duas linhagens de clulas:
-- clulas HeLa
-- clulas L
O meio em que cultivou estas clulas continha:
-- Mistura de sais
-- Carbohidratos
-- Aminocidos
-- Vitaminas suplementadas com soro de protenas

Histria
VARIANDO ESTES COMPOSTOS
Eagle determinou os necessrios para o crescimento
celular:
-- Sais
-- Glicose
-- 13 a.a.
-- Vitaminas
-- Juntamente com soro de protenas
Actualmente ainda usado o meio desenvolvido por Eagle
como meio bsico para cultura de clulas animais.
O seu uso permitiu aos cientistas cultivar uma ampla
variedade de clulas sob condies experimentais definidas.

Classificao
Cultura celular
Mtodo cada vez mais utilizado que consiste em cultivar
clulas isoladas fora do organismo onde existe.
H dois tipos de cultura celular:

Cultura primria: cultura preparada directamente de tecidos

de um organismo, com ou sem passo inicial de fraccionamento
das clulas.

Cultura secundria: as clulas cultivadas foram retiradas

de uma cultura primria, elas podem ser repetidamente
subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.

Heterocarion
possvel fundir uma clula com outra para formar uma clula
combinada, com dois ncleos separados;

Fig. 2 - Heterocario

Hibridoma

Fig. 3 Hibridoma

Linhagem de clulas
As clulas podem proliferar indefinidamente e podero ser
propagadas como uma linhagem de clulas;
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podem ser preparadas a partir de
clulas cancergenas

Linhagem de clulas
Tanto as linhagens de clulas transformadas quanto as de
clulas no-transformadas so extremamente teis na
pesquisa celular, como fonte de grandes quantidades de
clulas de um tipo uniforme;
As linhagens de clulas transformadas podem frequentemente
causar tumores, se injectadas num animal susceptvel;
Porm
Clulas de um mesmo tecido podem diferir entre si.

Linhagem de clulas
Assim

A uniformidade gentica de uma linhagem de clulas pode ser

melhorada pela clonagem celular, em que uma nica clula
isolada e prolifera-se para formar posteriormente uma colnia;

Podem ser armazenadas em azoto (N) lquido a - 196C, por um

perodo muito longo e continuarem viveis, quando
descongeladas.

Exemplos de cultura de clulas

Fig. 4 Clulas em cultura

Preparao
A- Isolamento
De forma a preservar mais informaes sobre cada tipo
individual de clulas, os bilogos desenvolveram meios de
dissociar as clulas dos tecidos e separar os vrios tipos;

Fig. 5 - Centrifugadora

Isolamento
O primeiro passo consiste em romper a matriz extracelular e as
junes intercelulares que mantm as clulas juntas;
As clulas de tecidos fetal ou neonatal so as melhores
produes de clulas dissociveis viveis;
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Atravs de tratamento:
-- dissociao mecnica
-- enzimas proteolticas - (tripsina e colagenase)
-- agentes - (cido etilenodiaminotetractico, EDTA)

Isolamento
Clulas grandes
so separadas
das clulas
pequenas e
clulas densas de
clulas no
densas por
centrifugao
fraccionada;

Fig.6 - Centrifugao fraccionada

Isolamento
Anticorpos que se ligam especificamente superfcie de
apenas um tipo de clula num tecido podem ser acopladas a
vrias matrizes como:
-- colagnio;
-- steres de polissacardeos ou plstico ;
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para formar uma superfcie de afinidade, qual somente as
clulas reconhecidas pelo anticorpo, se aderem.

Isolamento
Marcao especfica
das clulas com
anticorpos acoplados
a um corante
fluorescente, em
seguida, a separao
destas clulas
marcadas das no
marcadas num
separador de clulas
activado por
fluorescncia;

Fig. 7 Citometria de fluxo

Preparao
B- Cultivo em placas de cultura
Geralmente as culturas so feitas a partir de suspenso de
clulas dissociadas de tecidos.

Fig.8 - Microdisseco

Placa de cultura
Ao contrrio das bactrias, a maior parte das clulas de
tecidos no esto adaptadas para viverem em suspenso e
necessitam de uma superfcie slida para crescerem e
dividirem-se, que agora usualmente a superfcie plstica de
uma placa de cultura de tecidos;

Certas culturas celulares incluem:

Factores de crescimento
+
|
|
estimulam a proliferao celular

Transferrina
|
|
transporta ferro para a clula

Composio de um Meio Tpico Adequado

para o Cultivo de Clulas de Mamferos
Aminocidos

Vitaminas

Sais

Outros

Protenas (necessrias em meios sem

soro, quimicamente definidos)

Arginina
Cistina
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina

Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina

NaCl
KCl
NaH2PO4
NaHCO3
CaCl2
MgCl2

Glicose
Penicilina
Estreptomicina
Vermelho de fenol
Soro

Insulina
Transferrina
Factores especficos de crescimento

Fig.9 Tabela de componentes de um meio tpico

Algumas clulas no crescem nem se diferenciam se a placa no

estiver coberta com componentes especficos da matriz extracelular

Vantagens da Cultura Celular

Possibilidade de estudar fenmenos,inacessveis em tecidos
intactos;
Controlo das condies ambientais (pH, temperatura,
concentrao de O2 e CO2, etc);
Obteno de clulas com boa homogeneidade e bem
caracterizadas;
Economia de reagentes, tempo, etc.
Conhecimento de comportamento e funo de uma populao
isolada de clulas;

Desvantagens da Cultura Celular

Gasto elevado de material;
Condio de crescimento da cultura;
Instabilidade de cultura celular;
Perda de caractersticas;
Dificuldade de extrapolao para o modelo de organismo
intacto.

Limitaes
Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos
da tcnica em condies asspticas, etc);
Perda de caractersticas fenotpicas;
Necessidade do uso de marcadores devido perda de
caractersticas fenotpicas;
Instabilidade das clulas (sobretudo em linhas celulares
imortais).

Aplicaes gerais da cultura celular

Produo de vacinas anti-virais;

Compreenso de fenmenos de neoplasia;
Estudo da Imunologia;
Ensaios de frmacos e cosmticos in vitro;

Exemplo
As clulas para anlise cromossmica devem ter crescimento
e diviso rpida em cultura.

As clulas mais acessveis so os leuccitos, especificamente

linfcitos T.

O procedimento seguinte, mostra como preparar, a curto prazo,

uma cultura destas clulas adequadas para anlise:

Exemplo
1)

Obtm-se uma amostra de sangue perifrico e acrescenta-se

heparina para evitar coagulao;

1)

A amostra de seguida centrifugada a uma velocidade que

permita aos leuccitos sedimentarem-se como uma camada
distinta;

1)

Os leuccitos so colhidos, colocados em meio de cultura

tecidual e estimulados a dividirem-se pelo acrscimo de um
agente mitognico (estimulante da mitose), a fitohemaglutinina.

Exemplo
4)

A cultura incubada cerca de 72 horas, at que as clulas

estejam a multiplicar-se rapidamente;

4)

Acrescenta-se, ento, uma soluo diluda de colchicina,

para impedir a concluso da diviso celular, inibindo a
formao de fusos e retardando a separao dos
centrmeros. Em consequncia, as clulas paradas na
metfase acumulam-se na cultura;

4)

Em seguida, adiciona-se uma soluo hipotnica para

causar tumefaco nas clulas, alisando-as e libertando os
cromossomas, mas mantendo os centrmeros intactos;

4)

Os cromossomas so fixados, espalhados em lminas e

corados por uma de vrias tcnicas e prontos para anlises.

Laboratrio do Servio de Biologia

Celular e Molecular da FMUP

Fig.10 e 11 Cmara de fluxo laminar

Laboratrio do servio de Biologia

Celular e Molecular da FMUP

Fig.12 e 13 Estufa de CO2

Laboratrio do servio de Biologia

Celular e Molecular da FMUP

Fig. 13 - Centrfuga

Fig. 14 Microscpio Invertido

Referncias
Alberts, B; Bray, D; Lewis, J; Raff, M; Roberts, K; Watson, JD (1997).
Biologia Molecular da Clula. 3a ed. Porto Alegre/RS: Editora Artes
Mdicas.
Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific
Publishers Limited; 1996; USA
Debergh, P.C.; Read, P.E. (1991) Micropropagation in: Debergh, P.C. &
Zimmerman, R.H. (eds). Micropropagation: Technology and Application.
London, Kluwer Acad. Publishers;
Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition;
Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books

Agradecimentos
Este trabalho foi possvel com a ajuda de
Prof Doutora Delminda Neves ;
Servio de Biologia Celular e Molecular da FMUP

E obrigado a TODOS!!!