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MTODOS DE CULTIVO

ACCION DE LOS AGENTES Y


QUIMICOS

El cultivo puro representa las condiciones


artificiales para el desarrollo de las
bacterias y otros microorganismos y las
condiciones
impuestas
a
los
microorganismos mediante el manejo del
laboratorio.
Para determinar las caractersticas de
especies concretas de microorganismos,
es imperativo que el organismo se aisl y
se desarrolle en el laboratorio como un
cultivo libre de otras especies.

Qu condiciones requiere el crecimiento microbiano?


medio de cultivo: Una solucin acuosa con los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios.

Los organismos crecen en un


medio de cultivo artificial se
requieren condiciones como:
temperatura,
grado de humedad y
presin de oxgeno
asi como un grado correcto
de acidez o alcalinidad
.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO


Segn su estado fsico
Lquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado
nmero de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
Slidos
Se pueden preparar a partir de medios lquidos a los cuales se les
aaden agentes solidificantes como agar, gelatina o slica gel. Se
utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

Segn la naturaleza de sus constituyentes


Medios naturales o complejos (Indefinidos)
Estn constituidos por sustancias complejas de origen
animal o vegetal y usualmente se complementan con el
aadido de minerales y otras sustancias. No se conocen
todos los componentes del medio de cultivo, ni las
cantidades exactas en que estn presentes.
Ej. Extracto de carne,
extracto de levaduras.
Medios sintticos (qumicamente definidos)
Se preparan a partir de ingredientes qumicamente puros y
por lo tanto,
Se puede conocer exactamente su composicin cuali y
cuantitativa.
Por su costo slo se emplean en procedimientos especiales.

E. coli
Medio definido

Medio Complejo

K2HPO4

7g

Glucosa

15 g

KH2PO4

2g

Extracto de
levadura

5g

(NH4)2SO4

1g

Peptona

5g

MgSO4

0.1 g

K2HPO4

2g

CaCl2

0.02 g

Agua destilada

1000 ml

Glucosa

4-10 g

pH

Elementos traza (Fe, Co,


Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)

2-10 g

Agua destilada

1000 ml

pH

3. Segn sus propsitos de uso


Medios de enriquecimiento
Al cultivo en medio lquido que resulte en un
incremento en el nmero de un tipo dado de
organismo en relacin con el nmero de otros
tipos de organismos que puedan estar en el
inoculo.
Puede contener sustancias que favorezcan el
crecimiento del organismo que nos interesa o
que inhiban el crecimiento de los otros tipos de
microorganismos presentes.

La selectividad de un cultivo de enriquecimiento


no est determinada nicamente por la
composicin qumica, sino que puede ser variada
significativamente modificando otros factores
tales como: temperatura, pH, fuerza inica,
iluminacin, aireacin etc.

Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento


de las especies del gnero Salmonella provenientes de
muestras de heces, orina, agua o alimentos

Adicin de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y


plantas.
Medios selectivos
Se diferencian de los enriquecidos por ser medios slidos y
estn diseados para el aislamiento de microorganismos
especficos.
Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para
auttrofos, la adicin de cristal violeta se inhibe el
crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como nica
fuente solo crecern los que usen maltosa.

Medios diferenciales
Son aquellos destinados a facilitar la
discriminacin de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de
crecimiento en dichos medios.
contienen indicadores de productos
derivados de la actividad metablica de los
organismos sobre algunos de los
componentes del medio.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar
fermentacin de carbohidratos.

Medios de mantenimiento
Suelen ser distintos a los de crecimiento
ptimo ya que el crecimiento y prolfico
suele ocasionar la muerte rpida de las
clulas.
Ej. Aadir glucosa y utilizarla los
microorganismos producen cidos,
acidificndose el medio por lo que es
preferible no utilizar glucosa en los medios
de mantenimiento

Importancia del cultivo de microorganismos:


Obtencin de cultivos puros.
Anlisis morfolgico, fisiolgico, gentico y otras
caractersticas.
Produccin.
Conteo de colonias (UFC)
Mtodos especiales de cultivo
Siembra en superficie sobre medio slido
Siembra en profundidad (vertido en placa)
Dilucin y solidificacin en tubo
Cultivo en clulas vivas
Cultivo en animales Mycobacterium leprae

Siembra por estras

Dilucin en serie

Tcnica de las diluciones en serie


Dilucin

Tipo de microorganismo

10-1 a 10-3

Hongos

10-4 a 10-6

Levaduras

10-7 a 10-10

Bacterias

Para el aislamiento de microorganismos se puede aplicar la tcnica de


aislamiento por estra o por extensin en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5 ml.)

Mantenimiento y preservacin de
cultivos puros.
Resiembra peridica en medios frescos.
Depende de el medio de cultivo
Temperatura propia para mantener los cultivos
El tiempo de resiembra.

Preservacin de cultivos con una capa de


aceite mineral.
Para cultivos en agar inclinado el aceite deber cubrir
mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del agar
inclinado.

Mantenimiento y preservacin de cultivos


puros.
- Liofilizacin. Proceso utilizado para la eliminacin de
agua, mediante desecacin al vaco y a muy bajas
temperaturas.
Almacenamiento a temperaturas muy bajas en
presencia de agentes estabilizantes como glicerol,
dimetilsulfxido, nitrgeno lquido(-196C)

CONTROL
MICROBIANO

Se pueden presentar de tres


formas
Fsico: Fuentes de radiacin de alta energa
(Calor,Luz UV) que oxidan la pared proteica y
prcticamente queman el microorganismo.
Biolgicos: Sustancias creadas por
organismos superiores para autodefensa,
generalmente son de tipo proteco y se
denominan enzimas. Ejem: lisozima.
Qumicos: Pueden ser a su vez, inorgnicos o
de sntesis orgnica
Ejemplo: Dixido de cloro (ClO2),
Isotiazolinas, cloraminas, bromuros de
alquilo, cloruros de alquilo o arilo, etc.

ESTERILIZACIN MEDIANTE PRINCIPIOS FSICOS


TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo
celular, las protenas se desnaturalizan al romperse los
enlaces de H y S en sus estructuras secundarias y terciarias,
bajo estas circunstancias se pierden las actividades
funcionales de dichas protenas como la funcionalidad
enzimtica .
Mesoflicas: 25C 37C
Psicroflicas: 4C 10C
Termoflicas: 80C
Clostridium botulinum
endosporas
Clostridium tetani

La aplicacin de calor representa uno de los


mecanismos ms importantes para producir
esterilidad.
Calor
Hmedo:es un factor importante para la
El ambiente
1.Desnaturalizacin
de protenas
destruccin
de microorganismos,
el calor debe
2.Oxidacin
de protenas
alcanzar
al microorganismos.
Calor Seco:
1.- desnaturalizacin de protenas
2.- Dao oxidativo
3.- Efecto txico por alta concentracin de electrolitos.

Efecto del calor

Dao en el inicio de la sntesis de protenas.


Salida de aminoacidos y de iones K+
Autodegradacin de cidos nucleicos
Dao en la membrana celular afectando el
paso de solutos al interior y la salida de estos.
Dao en la respiracin, el mecanismo reside
en la membrana.

Mtodos por CALOR SECO:

Estufas de aire caliente.


Estas constan de una doble cmara, el aire
caliente generado por una resistencia
elctrica circula por la cavidad principal y por
el espacio entre ambas cmaras, a
temperaturas variables, entre
180C
250C, ciclos de 1-2 h.
Indicador Biolgico: B. Subtilis var. Niger
Tipo de material:
Instrumental quirrgico (metlico)
Material de vidrio, porcelana y metal
Polvos termoestables
Grasas, aceites, parafinas, ceras....

Llama directa
Consiste en colocar el material directamente al fuego
hasta que ste se ponga al rojo vivo. De esta forma
se queman los contaminantes hasta reducirlos a
cenizas.
microbiologa para esterilizar el asa con la llama del
mechero.
.

Incineracin
El material a esterilizar se coloca en cmaras
especiales que alcanzan elevadas
temperaturas. Con este mtodo se queman
los contaminantes hasta reducirlos a
cenizas.
Es una forma efectiva de esterilizar el
material contaminado a descartar tales
como bolsas, papel, uniformes desechables,
cadveres de animales,

CALOR HMEDO

Elementos autoclave El vapor bajo presin es el


agente de esterilizacin ms eficiente
confinamiento de vapor en un recipiente
cerrado, la presin se eleva y la temperatura
aumenta en forma correspondiente. Con una
presin de 1.05 Kg/cm3, la tempartura del vapor
alcanza 121C, con una atmsfera libre de aire.
Elementos del autoclave:
Sistemas control de presin y vlvulas
seguridad
Llave de purga para eliminar el aire
Indicador Biolgico:
Bacillus sterothermophillus

Ventajas
Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto
tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico
Desventajas
No permite esterilizar soluciones que
formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos
metlicos

Agua en ebullicin.
El efecto letal aumentar si se le adiciona
carbonato de sodio al 2% o detergentes,
las esporas que son resistentes al agua en
ebullicin x + de 2 h, pueden morir a 98C
en 10 a 30 min. En sol. De carbonato de
sodio al 2%.

PASTEURIZACIN
Pasteurizacin Lenta: 62.9C por 30 min.,
seguido de un enfriamiento rpido a 4C.
Pasteurizacin Rpida: 71.6C 80C durante
15 segundos y rpidamente refrigerarla.
Ultrapasteurizacin: 100 C durante fracciones
de segundos procediendo a la inmediata
refrigeracin.
Principales microorganismos patgenos que
provocan tuberculosis, brucelosis, fiebre de
tifoidea, difteria, escarlatina y la fiebre Q, como
la mayor parte de los microorganismos que
provocan que la leche se agrie.

Tyndalizacin:
Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua,
se basa en el principio de Tyndall.
Las bacterias que resisten una sesin de calefaccin,
hecha en determinadas condiciones, pueden ser
destruidas cuando la misma operacin se repite con
intervalos separados y en varias sesiones.
Se efecta por medio del autoclave de Chamberland,
dejando abierta la vlvula de escape, o sea funcionando
a la presin normal. Puede tambin realizarse a
temperaturas ms bajas, 56 u 80 para evitar la
descomposicin de las sustancias a esterilizar, por las
temperaturas elevadas.

MTODOS MECNICOS
FILTRACION
- Para materiales termolbiles y sensibles a radiaciones.
- Tamao del poro: 0.005-1 .
- Los virus no son retenidos
Filtros de membrana
Filtros HEPA
ULTRASONIDOS
- Vibraciones de alta frecuencia (poca penetracin).
- Desnaturalizar las protenas y componentes bacterianos.
- Se emplean en un bao de agua para limpieza de material

FILTRACIN
Este procedimiento es aplicable a la esterilizacin
de lquidos y gases, especialmente los primeros.
Cuando el lquido a filtrar no puede resistir, sin
descomponerse , la accin del calor, se aplica la
tcnica de filtracin, la que puede efectuarse
mediante presin o aspiracin.
filtros de porcelana "de Chamberland" y los de
tierras infusorias calcinadas "Berkefield"
Esponjas de asbesto filtros de Sietz
Membrana de ester de celulosa de 8 0.25
Ej. Vacunas, cuantificacin bacterias en agua y
aire, separar toxinas de las bacterias, antibiticos,
protenas, cateter,

Esterilizacin por filtracin

RADIACIN
Como la transmisin de energa a travs del espacio.
Radiaciones ionizantes: ( rayos x, rayos gamma y
rayos catdicos) y rayos ultravioleta,
Ej. Artculos farmacuticos, plsticos como cajas de
petri, jeringas, catteres.
Rayos x para preservar frutas, vegetales y carne de
cerdo.
Luz ultravioleta, longitud de onda corta cubre un
espectro que va desde una manera parcial visible
hasta una totalmente obscura, longitud de onda
desde 390 a 40 nm, con un efecto letal mximo a
260 nm

MTODOS QUMICOS

AGENTES QUMICOS
Son agentes que matan o inhiben el
crecimiento de los microorganismos.
Antisptico
Desinfectante
Conservadores

ANTISPTICO
Agentes microbicidas que pueden aplicarse
sobre la piel y mucosas, pero no pueden usarse
internamente.

Desinfectantes

Agentes que matan organismos pero no


necesariamente sus esporas y no deben aplicarse
sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como
mesas, pisos, utensilios, etc.
Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados,
soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio
cuaternario, etc.

Conservadores
Agentes usados frecuentemente en alimentos pero
tambin en productos farmacuticos para inhibir
el crecimiento de organismos Por consiguiente al
ser ingeridos no deben ser txicos.
Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio,
formaldehdo, nitrato, dixido de azufre.

Naturaleza de los microorganismos


presentes: Potencia de los
desinfectantes
1. Alto nivel: Inactivan todas las bacterias vegetativas,
incluyendo a micobacterias, hongos, virus, pero no
necesariamente esporas bacterianas (Ej. Aldehdos,
derivados del Cl)

2. Nivel intermedio: No eliminan esporas bacterianas, s


bacterias vegetativas, hongos y virus, pero con dificultad
virus desnudos de pequeo tamao ( Ej. Alcoholes,
fenoles)

3. Bajo nivel: no destruyen a todos los hongos, ni a los


virus desnudos de pequeo tamao (Ej. Derivados del
amonio cuaternario)

Etanol (50-70%)Desnaturaliza protenas y


solubiliza lpidos
Isopropanol (50-70%)Desnaturaliza protenas y
solubiliza lpidos
Formaldehdo (8%)Reacciona con grupos-NH2,
-SH y -COOHDesinfectante, mata endosporas
Cloro (Cl2) gas .Forma cido hipocloroso (HClO),
un fuerte agente oxidante Desinfeccin en
general y en particular para agua potable
Detergentes (ej. amonios cuaternarios). Ruptura
de membranas celularesDesinfectantes y
antisptico de piel

Condiciones fsico-qumicas para una buena


eficacia de la sustancia
1. Tiempo de exposicin
2. Temperatura
3. Concentracin
4. pH

Principales compuestos antimicrobianos


GRUPO
Fenoles

Fenol, cresol

MODO DE ACCIN

APLICACIN

Desnaturalizan protenas
Daan la membrana

Desinfeccin en hospitales y laboratorios


(instrumentos y superficies)
Antisptico en jabones y lociones

Hexaclorofeno
Alcoholes

Etanol
Isopropanol

Desnaturalizan protenas
Disuelven lpidos

Etanol es el ms usado. Antipeptico de la piel.


Desinfectante de termmetros y superficies en
clnica

Halgenos

Yodo

Oxidante, yoda protenas

Antisptico de la piel en forma de tintura o


yodforos

Oxidante

Desinfectante. Sistemas de distribucin de agua


potable, piscinas. Industria lechera

Cloro
Perxido de
hidrgeno

H2O2

Oxidante

Antisptico en pequeas heridas

Metales
pesados

Hg, Ag

Inactivan protenas

Desinfectantes en el laboratorio. Antispticos en la


piel y ojos

Detergentes
catinicos

Cloruro de
benzalconio

Alteran membranas
Desnaturalizan protenas

Desinfectantes de utensilios y pequeos


instrumentos
Antispticos cutneos

Aldehdos

Formaldehdo
Glutaraldehdo

Agentes alquilantes

Desinfeccin de material de laboratorio y


quirrgico. Son esporicidas y se pueden usar como
esterilizantes

Gaseosos

Oxido de etileno

Agente alquilante

Esterilizacin de material sensible al calor como


placas Petri, jeringas de plstico, catterres

Condiciones de un buen biocida


Debe tener un amplio espectro de actividad, es decir, debe
cubrir una amplia gama de microorganismos(bacterias, virus
y hongos).
Efectivo a baja concentracin: Mientras ms baja es la dosis,
ms econmico resulta el tratamiento.
Efectivo en un amplio rango de pH.
Solubles en agua.
Compatible con otras especies qumicas en el medio.
Alta persistencia: Debe ser efectivo a travs del tiempo.
Fcil de neutralizar: Debe poseer mecanismos desactivadores
para su posterior neutralizacin.
Baja toxicidad humana: No debe ser perjudicial en su
manipulacin segura por parte del operador.
El coeficiente fenolico, es un valor experimental que se
realiza a las sustancias que tienen propiedades biocida,
tomando como referencia la capacidad biocida del fenol.

Conservadores
cido propionico y propionatos0,32% Agente antifngico
en panes, quesos
Acido srbico y sorbatos0,2% Agente antifngico en
quesos, mermeladas, jugos
Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifngico en
margarina, sidra, bebidas gaseosas.
Acido lctico variable Agente antimicrobiano en queso,
manteca, yogur.
Dixido de azufre, sulfitos200-300 ppm Agente
antimicrobiano en frutas secas, uvas.
Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en
alimentos curados, pescado
Cloruro de sodio variable Previene el deterioro
microbiano en carnes, pescado, etc.
Azcar variable Previene el deterioro microbiano en
mermeladas, jugos, jaleas, etc.

Agentes biolgicos
son sustancias sintticas, semisintticas o
producidas por organismos capaces de matar o
inhibir el desarrollo de otros organismos.
Los agentes antivirales, antibacterianos y
antifngicos, se definen como aquellos agentes
biolgicos capaces de inactivar virus, bacterias y
hongos, respectivamente.

Pueden variar segn la toxicidad selectiva


que presenten, los antibiticos no actan
de manera similar en todos los tipos
celulares -por el contrario- presentan una
toxicidad selectiva y segn se trate de una
agente antifngicoo uno antibacteriano,
inactivar clulas fngicas o bacterianas.
Para el control de las enfermedades
infecciosas en plantas, animales y
humanos es indispensable el uso de
antibiticos con la capacidad para inhibir
las bacterias u otros m.o. sin causar dao
al husped.

Mecanismos de accin
1- Inhibicin de la sntesis de peptidoglicano
a- Antibiticos beta-lactmicos naturales y semisintticos
(penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactam)
b- Vancomicina (natural)
c- Bacitracina (natural)
2- Alteracin de la membrana citoplasmtica
a- Polimixina B (natural)
b- Anfotericina B (natural)
c- Nistatina (natural)
d- Imidazoles (natural)
3- Inhibicin de la sntesis proteica
Bloqueo de la transcripcin (prevencin de la sntesis de ARN)

a- Rifampicina (natural)

b- Etambutol (no natural)


Bloqueo de la traduccin (alteracin de ribosomas bacterianos)

a- aminoglicsidos (natural)

b- tetraciclinas (natural)

c- Lincosamina y clindamicina (natural)

d- macrlidos (naturales y semisntticos)


4- Interferencia con la sntesis de ADN
a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina)
b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)

Factores a considerar en la seleccin del


mtodo de desinfeccin
Microorganismos:
- Grado de muerte microbiana requerido
- Naturaleza microbiana (virus, bacterias...)

Instrumental
- Uso al que se destine
- Naturaleza del objeto a tratar

Costo del procedimiento


Facilidad/accesibilidad de la tcnica
Impacto medioambiental

A
R
G

S
A
CI