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ANALISIS DE PROTEINAS

MEDIANTE

LECTROFORESIS E INMUNOTRANSFERENC

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EN QUE CONCISTE
LA
ELECTROFORESIS
?
La electroforesis incluye tcnicas de separacin en
un campo elctrico de partculas cargadas
(protenas).
El proceso se diferencia en funcin de los
electrodos, el tampn de electroforesis y el
soporte que utiliza.

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Materiales
Electrodos: (platino de alta calidad)
Tampn de electroforesis:
Mantener el pH constante
El rango de pH debe estar entre 4 y 9.
No debe haber interacciones
La fuerza inica del tampn de electroforesis
(electrolito) debe estar controlada
Soportes: dos tipos de geles; acrilamida para protenas y
de agarosa cidos nucleicos.
Geles de Acrilamida:

Se puede controlar los tamaos de poro.


Se pueden polimerizar con la forma que convenga
Soportan una amplia gama de tampones.
Permiten separaciones rpidas.
Permiten una amplia gama de tinciones.

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Electroforesis
discontinuas
Este tipo de electroforesis se caracteriza por la utilizacin de
dos tipos de geles:
Un gel de separacin, en el que el porcentaje de acrilamida
se elige en funcin de la protena o protenas que se desea
separar
Un tampn compuesto por Tris/HCL y con pH 8,8.
Un gel de concentracin en el que se polimerizan los
pocillos.
La corriente que se genera es continua y la transportan los
iones Gly del electrolito. Cuando el in Gly penetra en el gel
concentrador, el pH cambia, se transforma en el in Gly0 y no
puede transportar la corriente.
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ELECTROFORESIS EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTES
Puesto que se trabaja con tampones que tienen diferentes pH, en principio el
efecto que tendra el pH en la carga de las protenas sera desconocido. Por
esta razn, la mayora de las electroforesis actuales se realizan en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).
Para ello se utiliza: TAMPN DE MUESTRA.
SDS, betamercaptoetanol, glicerol, Tris/HCl (pH 6,8) y azul de bromofenol.
1. El SDS.- es capaz de unirse a las protenas y conferirles carga negativa
debido a que enmascara la propia carga de las protenas.
2. El betamercaptoetanol reduce cualquier puente disulfuro de la protena.
3. El glicerol .-aumenta la densidad y asegura que la muestra tenga en el
pocillo una densidad superior que la del electrolito y la muestra permanezca
estable.
4. El azul de bromofenol se utiliza como marcador del frente de
electroforesis, que en principio, garantiza que por detrs se encuentren las
protenas; e indica cundo se debe interrumpir la electroforesis.
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INMUNOTRANSFERENCIA
(WESTERN BLOT)
Se emplea para la deteccin y caracterizacin de
protenas que se basa en la especificidad de
reconocimiento entre antgeno y anticuerpo.
Implica la separacin por electroforesis por el
sistema SDS-PAGE y una transferencia cuantitativa
e irreversible a una membrana de PVDF de las
protenas de una mezcla compleja (lisado total
celular).
Los antgenos que se han transferido a la
membrana son reconocidos por anticuerpos
monoclonales o policlonales especficos de ellos.
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Sistemas empleados:
Se usa el mtodo conocido como:
transferencia semiseca en el cual dicha transferencia
se realiza en horizontal y entre papeles de filtro saturados
en tampn de transferencia (usamos el Extra Thick Blot
Paper de Bio-Rad, ref. 170-3968).
Este sistema reduce la cantidad de tampn necesario,
y adems permite transferencias ms rpidas, debido a
que los electrodos se encuentran ms prximos.
Para la electroforesis se usa el Mini Protean 3
Electrophoresis System.
Para la transferencia, el Trans Blot SD semi-dry cell,
Fuente de alimentacin, la Power Pac HC,
La transferencia se realiza en 40 min a un voltaje
constante de 20 V.
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Membranas:
Ms utilizadas son PVDF (fluoruro de polivideno)
que son hidrfugas, por lo que es muy
importante sumergirlas en metanol, despus en
agua y otra vez en metanol, 5 min cada una de
las inmersiones y por ese orden, para
posteriormente tenerlas 15 min sumergidas en
tampn de transferencia a una temperatura de
4 C.
Ventajas:
Alta capacidad para unir biomolculas
Son ms manejables
Permiten una amplia gama de tinciones
reversibles y mtodos de deteccin.
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Tincin reversible:
La solucin rojo Ponceau (0,5% Ponceau-S red, 1% cido
actico) permite una tincin reversible, fcilmente
eliminable, que provee bastante informacin. La
membrana se mantiene unos minutos en la solucin y, a
continuacin, se destie en agua destilada, lo que
permite visualizar los marcadores de peso molecular y
cada uno de los carriles transferidos; se puede marcar
sobre la membrana con lpiz antes de proceder al
desteido total de la membrana con agua, lo cual es
necesario para continuar con el proceso de la membrana.
Nosotros utilizamos marcadores de peso molecular
preteidos de Bio-Rad (Prestained SDS_PAGE
Standard, broad range, ref. 161-0318).
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Inmunotransferencia:
Bloqueo.- las membranas con el material transferido se bloquean para
impedir uniones inespecficas del anticuerpo que se utiliza en la tcnica.
Para el bloqueo se puede usar BSA, que en teora sera la ms adecuada para el
bloqueo de protenas fosforiladas, pero la membrana no sale muy limpia, por lo
que nosotros usamos leche desnatada deshidratada al 5%.

Anticuerpos.- Las protenas inmovilizadas en la membrana se incuban


con anticuerpos primarios especficos, que permiten identificar y cuantificar
protenas concretas de una mezcla compleja de protenas.
En la actualidad se usan fundamentalmente dos tipos de preparaciones de
anticuerpos para Western blot:
Anticuerpos policlonales, cuyas preparaciones incluyen mltiples molculas
de anticuerpo que se unen a un antgeno concreto.
Anticuerpos monoclonales, que poseen la ventaja de que son especficos en
sus interacciones porque nicamente se unen a un eptopo en particular.
El problema es el hecho de que reconozcan pequeas regiones de la secuencia
polipeptdica; esto puede producir reacciones cruzadas con otros polipptidos.
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Deteccin.
Nosotros utilizamos un mtodo que consistente en la utilizacin de
anticuerpos secundarios con una actividad enzimtica.
Estos anticuerpos se unen especficamente a las regiones de los
anticuerpos primarios que no se unen a los antgenos.
Cuando utilizamos un anticuerpo primario que se obtuvo de un animal
(p. ej., de ratn), tenemos que usar como anticuerpo secundario uno
que se haya producido en otro animal (p. ej., conejo o cabra) y que sea
capaz de reconocer el anticuerpo primario en las regiones que no se
unen al antgeno.
Las actividades enzimticas que se suelen utilizar conjugadas con
anticuerpos secundarios son la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa
horseadish (HRPO), ya que permiten la deteccin de la unin antgenoanticuerpo mediante sustratos luminiscentes. Nosotros usamos un kit
comercial llamado ECL Western Blotting, Amersham, que se basa
en la accin de la actividad enzimtica HRPO o AP sobre compuestos
(como el luminol), generndose compuestos que dan lugar a luz y
cuyos efectos suelen durar unos 15 min.

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Reutilizacin de la membrana. La reutilizacin de las membranas de PVDF reveladas con


sistemas luminiscentes es la ms sencilla, puesto que este
tipo de membrana es mucho ms manejable y menos
deteriorable y los productos luminiscentes son solubles y
no se depositan sobre la membrana.
Para la reutilizacin es necesario eliminar completamente
las uniones de los anticuerpos primario y secundario con el
antgeno y entre s, respectivamente. A este proceso se lo
denomina stripping y consiste en la incubacin de la
membrana con una solucin compuesta por
betamercaptoetanol, SDS y tampn Tris/HCl pH 6,8 a una
temperatura de 50-65 C. Antes y despus se realizan
abundantes lavados, que facilitan la eliminacin de los
anticuerpos y de la propia solucin de stripping. A
continuacin se procede al bloqueo tal y como hemos
indicado anteriormente.
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APLICACIONES DEL WESTERN BLOT


SUS APLICACIONES SON MUY
NUMEROSAS.

ENFERMEDADES INFECCIOSAS
ENFERMEDADES HEREDITARIAS Y CONGNITAS
ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS
EL CNCER, TANTO PARA EL DIAGNSTICO PRECOZ Y
EL TRATAMIENTO COMO EN INVESTIGACIN BSICA Y
APLICADA
EN LA INMUNOLOGA
EL ENVEJECIMIENTO CELULAR
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