BCM13042

Fundamentos de Protenas
Aula 3 Estratgias de Purificao e
Anlises de Protenas

Principais componentes moleculares da bactria E. coli

Componentes
H2O
Protenas
Ac. Nuclico
Carbohidratos
Lipdeos
Outros

N de molculas diferentes
1
3.000
1 - DNA e 1000-RNA
50
40
ons - 12
Mol. Monomricas - 500

% peso total
70
15
7
3
2
3

O isolamento ou purificao de uma protena uma etapa que precede

os estudos de suas caractersticas fsico-qumicas, de sua estrutura 3D
e a compreenso de suas propriedades biolgicas.
Inicialmente, a estratgia de purificao de uma protena emprica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada
protena individualmente. No h como prever quais mtodos sero os
mais eficientes para se purificar uma protena pela primeira vez.

Mtodos de Isolamento de Biomolculas

Existe uma grande variedade de mtodos visando a separao de biomolculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar uma protena, o grupo
de molculas com maior diversidade, as metodologias de separao de protenas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opes disponveis.
Os mtodos de separao de biomolculas so agrupados em duas categorias:
Mtodos baseados em caractersticas fsico-qumicas das biomolculas:
1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifuao, dilise, gel-filtrao)
2. Carga eltrica (ex: cromatografia de troca inica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Mtodos baseados em afinidade biolgica, que exploram a interao entre duas
molculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupe que uma das molculas do par que
interage um reagente de fcil obteno, disponvel comercialmente)

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g)

SOBRENADANTE

ORGANELAS

Lisossomos
Lisossomos
Mitocndria
Mitocndria
Golgi
Golgi
Ncleo
Ncleo

Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

O fluxograma ao lado representa a

marcha de purificao de uma protena,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de mtodo, que levam ao
isolamento de uma protena presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de protenas
(100g) presente no material inicial e
quanto da protena purificada se obtm no
final (0,001g). Esses nmeros so tpicos
para a purificao da maioria das
protenas, em especial enzimas.

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica

(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

Em cada etapa, a protena de interesse

separada das demais com base em uma
propriedade diferente. Consequentemente, as protenas ainda misturadas com
aquela que est sendo isolada so cada
vez mais semelhantes em suas
caractersticas fsico-qumicas, exigindo
mtodos cada mais sensveis, capazes
de explorar pequenas diferenas, para se
chegar protena pura.

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g)

Alm dos mtodos de purificao, anlises

SOBRENADANTE

ORGANELAS

Lisossomos
Lisossomos
complementares devem ser feitas ao longo da
Mitocndria
Mitocndria
purificao, para verificar se o processo de
Golgi
Golgi
separao est sendo eficiente.
Ncleo
Ncleo

Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica

(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

A medida da atividade biolgica da protena

de interesse e do contedo de protenas de
cada frao resultante do processo de
separao devem ser feitas a cada passo.
Assim, apenas a frao que contm a
protena de interesse, marcada com um
crculo vermelho no fluxograma, submetida
prxima etapa de purificao.
Medida da atividade biolgica
- particular para cada protena
- deve ser quantitativa, para estimar quanto
da protena de interesse h em cada frao.
Medidas do contedo proteico (diversos)
- absorbncia de luz UV de 280 nm
- mtodos colorimtricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

Absortividade molar,

Mtodos para medida do contedo de protena:

Comprimento de onda

A absorbncia de uma soluo de protenas a 280 nm diretamente proporcional ao seu contedo

proteico, desde que essas contenham esses aminocidos aromticos na sua composio,
especialmente triptofano.
A vantagem desse mtodo que ele no destrutivo para a protena. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentrao de 1 mg/mL.
cidos nucleicos tambm absorvem luz UV mxomo 260 nm. Protena: razo A280/A260 > 1

Mtodos para medida do contedo de protena:

Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato
Cu2+ reage com as ligaes peptdicas e produz um
complexo prpura com absoro mxima em 540 nm
1. Cu2+ chelado pela protena
[Cu2+-proteina]
2. Reao redox
Cu2+ + (ligaes peptdicas) > [Cu+ -protena]
Mtodo de Lowry
ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de
protenas e cadeias laterais de aminocidos
aromticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o
reagente de Folin-Ciocalteu (cido fosfomobidnio-tungstnio), dando um composto
de cor azul.

Reagente Bradford
= Coomassie
Brilliant Blue G-250

Mtodo baseado em uma mudana espectral do

reagente, em que d absoro mxinma a 595 nm (cor
azul), quando interage com protenas.
Interao com protenas se d atravs de
foras de Van der Waals e ligaes inicas,
especialmente com arginina, mas tambm com
resduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
fenlialanina.

BCA = cido 2,2'-Bicinchonnico ou

4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
ons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presena de
protenas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,

Para iniciar a purificao, inicialmente necessrio extrair a protena de interesse

para um meio lquido, exceto se ela j estiver naturalmente presente em um meio
lquido (sangue, suor, gua do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

Material na
fonte

por ultra-som

com
detergente

Vrios mtodos so
possveis para transformar
clulas, rgos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.

clulas
Homogeneizao
(para romper tecidos e clulas)

tecidos

por presso
(prensa francesa)

liquefao
(Potter)

Homogenado
ou
Extrato bruto

Material
de
partida

Sendo a protena de interesse

uma protena de membrana,
necessrio solubiliz-la. Para
esse fim so utilizados
detergentes, que dissolvem a
membrana plasmtica e
formando complexos solveis
com as protenas.
Detergentes podem ser
inicos e no inicos

detergente

micelas

Dependendo da concentrao

Protenas
integrais da
membrana

Complexos
no micelares

Detergentes inicos

Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide

SDS
Dodecil sulfato de
sdio

Detergentes
no inicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)

Deoxicolato de sdio

Octilglicosdeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)

A centrfuga
Cmara blindada

Amostra
sedimentando

rotor
ngulo
fixo

refrigerao

A centrifugao frequentemente uma das primeiras

etapas de purificao aplicado a um extrato bruto. Atravs
do movimento de rotao do rotor da centrfuga, uma fora
centrfuga aplicada amostra, separando seus componentes atravs de suas massas e/ou densidade, conforme
a tcnica.
Atravs de sucessivas etapas de centrifuo com
velocidades (rotaes por minuto, rpm) crescentes, podese obter diferentes fraes de um homogenado de clulas
ou tecidos.

centrifugao diferencial

vcuo
homogenado

clulas intactas
pedaos de membrana
ncleos

sangue centrifugado: separao de plasma e clulas

mitocndrias
lisossomos
ribossomos

frao
citoplasmtica

Fora centrfuga

Existem centrfugas para diferentes tipos de aplicaes,

dependendo da fora centrfuga que so capazes de gerar.

Relao entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a fora centrfuga (g)

Centrfuga
Clnica
1,200g por 15 minutos
separa plasma de
clulas sanguneas

Ultracentrfuga
(necessitam vcuo
para evitar atrito do ar,
alm de refrigerao)

R$ 3.000

US$ 70,000

Preo aproximado

200,000 g por 24
horas para separar
organelas menores
ou complexos
proteicos

A centrifugao em um
meio com gradiente de
densidade melhora a
eficincia da separao. As
partculas se deslocaro
atravs do gradiente at
encontrarem uma regio
com densidade equivalente
a sua, quando param de se
mover, formando bandas.

Centrifugao em gradiente de densidade

Soluces de sacarose com
densidades diferentss so
colocadas no tubo, uma
sobre a outra

Gradientes podem ser

utilizados para separar
diferentes tipos de clulas,
organelas, cidos
nuclicos, complexos
proteicos, etc.

Amostra colocada no
topo do gradiente
5% sacarose

20% sacarose

Baixa densidade
Mdia densidade
Alta densidade
centrifugao

Gradiente

separao de:

Ficoll-Hypaque
Sacarose
Cloreto de csio

leuccitos
mitocndrias
cidos nuclicos

As mais potentes ultracentrfugas atuais ainda no so capazes de sedimentar protenas.

Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitao fracionada de protenas
so utilizados como etapas preliminares de purificao. Uma das vantagens desses mtodos
o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitao de protenas pode ser induzida por:
- adio de sais (Precipitao salina)
- adio de solventes
- variao de pH (Precipitao isoeltrica)
Salting-in X Salting-out

Solubilidade da hemoglobina (S/S)

NaCl

KCl

MgSO4

(NH4)2SO4
K2SO4

Concentrao do Sal,, Molar

O grfico ao lado ilustra o efeito de

diferentes sais sobre a solubilidade
da hemoglobina.
Em baixa concentrao salina, a
solubilidade das protenas aumenta,
pois os ons do sal ajudam a reforar
a camada de solvatao.
Em alta concentrao salina, a
solubilidade das protenas diminue
pois os ons do sal competem pelas
molculas de gua disponveis para
formar a sua prpria camada de
solvatao.
Sais com nions divalentes so mais
eficientes do que os monovalentes
na precipitao de protenas.

Sais se dissociam em soluco aquosa e competem com as protenas pela gua de solvatao.

Hemoglobina

Solubilidade, log

Albumina

Fibrinognio

Considere uma soluo com fibrinognio,

albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o grfico.

Mioglobina

Pseudoglobulina

Concentrao do Sal (NH4)2SO4,, Molar

Protenas apresentam diferente sensibilidade

para a precipitao salina.
- precipitam primeiro:
protenas maiores
protenas mais hidrofbicas

Usando o sal sulfato de amnio (NH4)2SO4,

pode-se purificar completamente o
fibrinognio a partir de uma mistura das 5
protenas, pois este precipita totalmente em
uma saturao de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a soluo e o
fibrinognio coletado como um precipitado.
Numa prxima etapa, adicionando-se mais
sal soluo at uma saturao de 7 M,
pode-se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos tambm purificada a mioglobina,
ainda em solvel na presena de 7M do sal,
e que ficou sozinha no sobrenadante.

possuem camadas de solvatao maiores

ou menos organizadas, mais fceis de pertubar.

Protenas tambm podem ser precipitadas com adio de solventes ao meio ou

quando colocadas em meio com pH prximo ao seu ponto isoeltrico.

Protena

P.I.

Pepsina

<1,0

Protenas colocadas em meio com pH igual ao seu PI

tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
a camada de solvatao menos organizada.

Ovalbumina galinha

4,6

Albumina srica humana

4,9

Tropomiosina

5,1

Insulina bovina

5,4

Fibrinognio humano

5,8

Gama-globulina

6,6

Colgeno

6,6

gua

Mioglobina equina

7,0

Hemoglobina humana

7,1

Ribonuclease A bovina

7,8

Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofrmio
Benzeno

Citocromo C equino

10,6

Histona bovina

10,8

Lisozima, galinha

11,0

Salmina, salmo

12,1

Ponto Isoeltrico de algumas Protenas

Solvente

Constante Momento
Dieltrica Dipolar
78.5
48.9
32.6
24.3
20.7
4.8
2.3

1.85
3.96
1.66
1.68
2.72
1.15
0.00

Solventes miscveis com a gua diminuem a constante

dieltrica do meio e desorganizam a camada de solvatao
das protenas.
Os mais utilizados so etanol e acetona.

Para obter as protenas precipitadas em soluo novamente,

necessrio reverter as condies que levaram precipitao.

Aos precipitados obtidos com sal ou

solvente, adiciona-se gua.

Membrana
de celofane

Ao precipitado obtido com variao

de pH, retornar ao pH original.

solvente

soluo a
ser dialisada

incio

final

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a dilise.

-amostra colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de molculas at 10,000 d.
- o saco contendo a amostra imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- aps vrias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente ter sido retirado.

MATERIAL BIOLGICO DE PARTIDA: (100g) At o momento, exploramos as

etapas iniciais de purificao de
protenas, como a centrifugao
Lisossomos
diferencial e precipitao
Mitocndria
SOBRENADANTE
ORGANELAS Golgi
fracionada.
Ncleo
Precipitao com
Sal/Solvente

F1

F2

F3 F4
Precipitao com
Sal/Solvente

F 2 .2

F 2 .1

F 2 .3

Cromatografia Troca Inica

F 2 .3.2

F 2 .3.1

. . . . . .

2. 3.N

Cromatografia Troca Inica

(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X
Gel Filtrao

1 Protena apenas
(0.001g)

- 0.1 a 0.5% total

Esses mtodos, apesar de terem

baixo poder de resoluo (exploram
diferenas grosseiras entre as
protenas), permitem processar
grandes volumes ou massas, tpicos
das etapas iniciais de isolamento.
Quando j houve reduo significativa dos montantes de protenas a
serem processados, iniciam-se as
cromatografias, que iro explorar as
diferenas mais sutis entre as
molculas.
No esquecer que todas as fraes
obtidas devem ter o contedo de
protenas e de atividade biolgica
medidos, para se decidir qual/quais
devero passar para o passo
seguinte da purificao.

Que caractersticas devem ter as resina cromatogrficas para possibilitar

separaes de molculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeao em gel ou gel-filtrao:

separao de molculas pela massa molecular
gis so porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca inica:
separao de molculas pela carga eltrica
gis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partio (fase reversa ou hidrofbica):
separao de molculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
gis possuem carcter hidrofbico
Cromatografia de afinidade:
separao de molculas pela capacidade de interagir com um ligante
gis possuem ligante especfico ligado covalente resina

Como se avalia se o processo de purificao de uma protena foi eficiente ?

Trs parmetros permitem avaliar a eficincia do processo de purificao de uma protena:
- Atividade especfica (AE): a razo entre a quantidade da protena de interesse, medida
atravs de sua atividade biolgica, e a quantidade total de protenas presentes
em cada etapa de purificao. Esse ndice aumenta ao longo da purificao.
- ndice de purificao: indica quantas vezes em relao ao material de partida a protena
de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razo entre as atividades
especficas inicial (material de partida) e final (protena pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da protena de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificao. Um certo grau de perda
inerente do processo de purificao (em cada etapa s devem ser processadas as fraes mais ricas em atividade biolgica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Tambm podem ocorrer perdas por desnaturao das protenas devido s
diferentes condies (pH, sais, etc) a que so submetidas nas diferentes
etapas de purificao. Espera-se recuperar o mximo possvel da protena de
interesse.

Purificao da Glicoquinase heptica de Rato

Etapa

b Rendimento
c
AtividadeEspecfica
ndiceb
.
a
-1
( U.mg
)
(%)
U
Purificao

Marcha A: somente cromatografias convencionais

1. Sobrenadante
de pncreas
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25
-55%
3. troca inica, coluna DEAE
-Sephadex, pH 7.0,eluioKCl
4. troca inica, coluna
CM-cellulose
, pH 5.5,eluioNaCl
6. interao hidrofbica, coluna
Butyl~Sepharose
7. gel-filtrao, coluna
SephacrylS-300

2.0
23
44
80
130

100
85
45
33
15
15

1
12
140

18
420

100
84
83

1
195
4.500

260
480
780

Marcha B: com cromatografia de afinidade

1. Sobrenadante
de pncreas
2. troca inica, coluna DEAE
- Sephadex
, pH 7.0,eluioKCl
3. Afinidade cromatogrfica
benzamidina~agarose
(
)

aU

nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimtica definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformao de 1 micromol de substrato em produto, em condies pre-estabelecidas
b Atividade especfica: medida da atividade biolgica (em U) expressa por miligramas de protena
c Rendimento: percentual da atividade biolgica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificao
d ndice de Purificao : razo entre a atividade especfica inicial e aquela determinada em cada etapa.

Funcionamento Bsico de uma Coluna Cromatogrfica

Uma coluna um tubo cilindrco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatogrfico. A coluna constantemente alimentada com lquido (tampo),
banhando a resina e forando o contacto desta e as molculas que esto sendo analisadas.
Abaixo est representado o esquema geral de uma cromatografia:

Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em
tampo

Mais tampo
colocado na
coluna,
forando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina

Os componentes da mistura so
separados por interao diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
massa molecular
carga eltrica
solubilidade
afinidade

Tempo 2

Tempo 1

Lquido
que sae
da coluna

recolhido
em tubos
de um
coletor de
fraes

Componentes da
amostra se
separam e saem
da coluna com
diferentes
volumes de
tampo

Coletor de
fraes
Um cromatograma, como o
grfico ao lado, a maneira
usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia.

Tempo n

Concentrao

Tempo zero

Tempo ou volume

Cromatografia de gel filtrao ou peneira molecular

Molculas com massas diferentes
protena grande
protena pequena

Fluxo do tampo
Tampo
empurra
molculas
atravs da
resina

gro da resina poroso

tubos

gros (beads) da
resina com poros

Na gel-filtrao, as protenas que penetram nos poros da resina precisam diferentes

volumes de tampo para sarem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos gros. Quanto maior o nmero de gros que cada molcula entrar durante o
percurso atravs da coluna, maior o volume necessrio para sua sada.
Protenas maiores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com
pouco tampo, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos gros, tambm chamado de
volume morto (Vo).
Protenas menores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com um
volume de tampo correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do prprio gel).

A cromatografia de gel-filtrao possibilita estimar a massa molecular de

uma protena em seu estado nativo

Para isso, necessrio calibrar a coluna com protenas de massa

molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibrao.
O volume de sada (eluio) de uma protena numa coluna de gelfiltrao proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

Ler a massa
correspondente

Molculas
maiores

20
25

50
75
100
volumeKav
de eluio

125 mL

traado da medida de atividade

biolgica nas fraes

40

60

80

Medir o volume de eluio

da frao mais ativa.
Transportar para a curva de
calibraao.

100

Molculas
menores

120 mL
volume

Medida da ativ. biolgica

Massa molecular (kD)

Observa
ra
escala
log

Absorbncia a 280 nm

Curva de calibrao

Alm de purificar, por ser realizada em condies de pH, fora inica

e temperatura que preservam a atividade biolgica da protena, a
gel-filtrao fornece a Mr do seu estado nativo.

Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtrao, conforme o tipo

de molculas ou partculas a serem separadas
indica quais os tamanhos
das partculas que podem
entrar nos poros da resina e
serem fracionados. Acima ou
abaixo da faixa, no h
separao.

Resinas para Gel-Filtrao

NOME

TIPO

FAIXA DE RESOLUO
(kD)

Sephadex G-10
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-100
Sephadex G-200

Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana

0.05 - 0.70
1-5
1 - 30
4 - 150
5 - 600

Bio-Gel P- 2
Bio-Gel P- 6
Bio-Gel P- 10
Bio-Gel P- 30
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-300

Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida

0.1 - 1.8
1-6
1.5 - 20
2.4 - 40
5 - 100
60 - 400

Sepharose 6B
Sepharose 4B
Sepharose 2B

Agarose
Agarose
Agarose

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio

10 - 4.000
60 - 20.000
70 - 40.000
-Gel: Bio -Rad Laboratories

Molculas pequenas

Protenas

Molculas pequenas

Protenas

Clulas, partculas sub-celulares

Esta uma outra forma de representar a calibrao de uma coluna de

gel-filtrao.
O gel nessa coluna o
Sephadex G-200, cuja
faixa de resoluo de
protenas de 5.000 a
600.000 d.
Observe como protenas
nos extremos da faixa
de resoluo tendem a
sair da parte linear da
curva.

Para comparar calibraes com a mesma resina cromatogrfica em colunas de

dimenses diferentes utiliza-se o Kav, que proporcional ao log de Mr.

Kav = Ve-Vo
Vt-Vo

onde:

Ve volume de eluio de uma certa protena

Vt volume total da coluna
Vo volume morto da coluna, em que saem molculas com

Cromatografia de troca inica

A resina para cromatografia de troca inica apresenta carga eltrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.

DEAE
Trocadora de nions

CM
Trocadora de ctions

Existem dois tipos bsicos: resinas trocadoras de nions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de ctions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Cromatografia de troca inica

---Ponto Isoeltrico de algumas Protenas

--

DEAE-celulose - pH < 10
CM-celulose - pH > 4

cido

PI

bsico

neutro

Protena

P.I.

Pepsina

<1,0

Ovalbumina galinha

4,6

Albumina srica humana

4,9

Tropomiosina

5,1

Insulina bovina

5,4

Fibrinognio humano

5,8

Gama-globulina

6,6

Colgeno

6,6

Mioglobina equina

7,0

Hemoglobina humana

7,1

Ribonuclease A bovina

7,8

Citocromo C equino

10,6

Histona bovina

10,8

Lisozima, galinha

11,0

Salmina, salmo

12,1

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica

Adsoro
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catinica ou
trocadora de nions, como o DEAE-celulose):

A cromatografia de troca inica compreende duas etapas:

1)
2)

adsoro das protenas com carga contrria

resina, e sada da coluna das protenas com a
mesma carga;
eluio das protenas adsorvidas.

+
+
+
+
+
+
++

Molculas com a mesma carga,

ou sem carga, no interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna

Eluio
Para a eluio, as condies de adsoro da coluna
(pH ou fora inica) so alteradas para neutralizar a
interao entre as protenas e a resina.

Na
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentrao do sal no tampo, pois alteraes de pH
podem desnaturar protenas, levando-as a precipitar
dentro da coluna.

Cl- +

+
+
+
+
+
+
++

Adio de sal ao tampo resulta em

competio entre os ons em soluo
e as molculas adsorvidas na resina.

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Inica

Gradientes de sal podem fracionar as protenas adsorvidas na resina de acordo
com a intensidade de suas cargas, que dada pela diferena entre seus PIs e o pH do
tampo de eluio.
As protenas no retidas (com a mesma carga da resina) no so separadas,
sendo simplesmente arrastadas pelo tampo (ou seja, no so repelidas pela resina).

Eluio NaCl

Eluio NaCl
+

0. 10 M

(-)

0. 15 M

++

CM

(-)
(-)

+
+ +

0. 20 M

0. 10 M

(+)

DEAE

(+)

0. 15 M

_
(+) =

0. 20 M

(+)

_
=

(-)

No retidas

Carboximetil~celulose
(trocadora de ctions)

+
+
+

No retidas

Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de nions)

Tipos de Resina de troca inica

NOME
Dowex 1

TIPO

GRUPO IONIZVEL
OBSERVAES
Tipos
de
Resina
de
troca
Inica
Fortemente bsica
- CH N (CH )
Troca aninica
2

DEAE-celulose

resina de polistireno
Fortemente bsica
resina de polistireno
Bsica

CM-celulose

cida

Q-Sepharose

Gel de dextrano
bsico

SP-Sepharose

Gel de dextrano
cido

Dowex 50

* Dowex: Dow Chemical Co.;

3 3

- SO 3-H

Troca Catinica

Dietilaminoetil
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2
Carboximetil
- CH2COOH

CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3

CH2-SO3-

Sepharose e Source: GE LifeSciences

Fracionamento de protenas
cidas e neutras
Fracionamento de protenas
bsicas e neutras
Combinao de gel filtrao
e troca inica de protenas
cidas e neutras
Combinao de gel filtrao
e troca inica de protenas
bsicas e neutras

Bio
- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vrios tipos de resinas de troca inica disponveis no mercado.

Cromatografia de afinidade:
Um dos mtodos mais
eficientes para a
purificao de protenas,
possibilitando um alto
rendimento com nmero
reduzido de etapas.
A separao de
molculas tem como
base a interao
especfica do analito
(molcula-alvo) com um
ligante imobilizado na
matriz. Foras
envolvidas nessa
interao podem ser no
covalentes
(eletrostticas,
hidrofbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).

Ex: cromatografia de imunoafinidade

Adsoro
Mistura de protenas
Eluio
Partculas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A

Lavagem

pH 2,0 ou sal

Anti-A
interage
apenas
com a
protena A

Coluna
empacotada
com ess gel

Desprezar
protenas no
retidas

Complexo
Ag-AC
desfeito

Antgeno A
puro -

Eluio: condies que interferem na ligao da protena ao

ligante, como mudanas no pH e/ou fora inica, ou
por competio com o ligante livre

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

1. Mono-especficos - ligao especfica da molcula-alvo
- anlogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antignicos de anticorpos
- ligantes com tag ou marcao
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-especfico: ligantes para separao de grupos:
Ligante
grupo-especfico

Especificidade

Protena A

Regio Fc de IgG

Protena G

Regio Fc de IgG

Concanavalina A

Grupos glicosil- ou manosil-

Cibacron Blue

Vrias enzimas, albumina

lisina

Plasminognio, RNA ribossomal

arginina

proteinases tipo tripsina

benzamidina

proteinases tipo tripsina

calmodulina

Protenas reguladas por calmodulina

heparina

Fatores de coagulao, lipases,

hormnios, receptores estorides, etc

Metais de transio

Protenas e peptdeos com resduos

de His expostos

8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para protenas com afinidade por cAMP
ou cGMP)

Stios de ligao das

protenas A, G e L
imunoglobulina, que permitem
a purificao de anticorpos por
cromatografia de afinidade

Preparo da resina de afinidade:

Estratgias para acoplamento de ligantes resina

Reagente
Alvo no ligante

Passo 1. Ativao da resina

Passo 2. Acoplar
o ligante

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) h o risco de impedimento

estrico entre a matriz e a molcula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligao resina.
A introduo de um brao espaador diminue esse risco.
Brao espaador covalente entre
a resina e o ligante

Molcula-alvo (analito)
ligante
Ligao reversvel no covalente

Cromatografia de Partio
Princpio: Explora diferenas de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicvel especialmente molculas pequenas, como compostos orgnicos, aminocidos, peptdeos,
acares, lipdeos, etc.
Apresenta limitaes para uso com protenas acima de 20-30kda, que so desnaturadas em presena
de solvente orgnico.

Fase estacionria
(suporte slido)

Consiste de 2 sistemas:
tempo 0

t1

t2

tn

Papel
ou placa
de slica

direo do
fluxo do
solvente

Amostra
na origem

Compostos
separados

Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)

Rf =

Fase mvel
(lquido ou gs)

CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Suporte: PAPEL
Fase Estacionria: Aquosa (H20 na celulose)
Fase Mvel: Solvente orgnico (hidrofbico)

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Suporte: SLICA (camada delgada ou TLC)

distncia de migrao da substncia

Fase Estacionria: slica (mineral apolar)

distncia de migrao do solvente

Fase Mvel: Solvente aquoso ou gua

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography

Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicaes para todos os tipos de cromatografias.
Caracterstica diferencial da cromatografia convencional:
partculas de resina com dimetro muito pequeno (poucos microns)
aumento da eficincia da separao em funo do nmero maior de partculas
de resina em um mesmo volume da coluna
fase mvel - necessita bomba de alta presso para ter fluxo atravs da coluna
Desenho bsico de um HPLC

Detector
Controle e
anlise dos
dados

Duas bombas permitem eluio em gradiente

Detector: ndice de refrao, absorbncia UV
ou Vis, fluorescncia, etc.

bombas

Injetor de
amostra

Coluna e
forno

Coletor de
fraes

Coluna pode ser aquecida para melhorar a

eluio diferencial na fase reversa

Fase reversa: resinas de slica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Molculas
retidas

100

% de acetonitrila

Absorbncia a 214 nm

Molculas
no retidas

Tempo ou volume de reteno

Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluio por um gradiente de acetonitrila
Fase estacionria
C18
C8
tC2
Aminopropyl
Cyanopropyl
Diol
CN Fenil

Funo
Si (CH3)2 C18 H37
Si (CH3)2 C8 H17
Si C2 H5
Si (CH2)3 NH2
Si (CH3)2 (CH2)3CN
Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH

NH2 C4 C8

C18

Reteno na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia

Condio de equilbrio: em meio cido

(0.1% de cido trifluoroactico) para
aumentar hidrofobicidade (protonar as
carboxilas)
Eluio com gradiente crescente de solvente
orgnico miscvel com gua
- acetonitrila, metanol, propanol

aminocido

A protena pura tratada com

HCl 6N fervente para quebrar
(hidrlise) as ligaes peptdicas.

A mistura resultante submetida

a mtodos cromatogrficos (fase
reversa, troca inica) para separar
os diferentes aminocidos.

fluorescncia

Para determinar a estrutura primria de uma protena,

necessrio primeiro conhecer a composio (nmero
e tipos) de seus aminocidos.

Tempo de reteno (min)

A posio do pico no cromatograma identifica o aminocido.

A rea do pico quantifica o aminocido.

Existem vrios mtodos para se determinar a sequncia de aminocidos de

uma protena. Aqui veremos como funcionam os dois mtodos
atualmente mais utilizados:

a) Mtodo de Edman: reao do aminocido N-terminal da protena com

fenil-isotiocianato
. A protena modificada submetida a
hidrlise cida liberando o aminocido N-terminal modificado, e este
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reao com o
prximo aminocido na protena, que se tornou o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinao das massas de fragmentos

correspondendo a aminocidos, retirados sequencialmente da protena.
Veremos mais sobre esse mtodo na aula sobre eletroforese e
protemica.

ciclo 1

Mtodo de Edman sequenciamento de protenas com

PITC (fenil-isotiocianato)

(1)

acoplamento

(2)

hidrlise com cido

trifluoroactico
Cada ciclo de reao compreende 3 etapas:
ciclo 2

acoplamento

1.
2.

(3)
hidrlise cida

3.
vai para novo ciclo

Reao da protena com PITC, que se

acopla ao grupo amino NH2- livre do
aminocido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
Hidrlise cida da protena conjugada
com PITC libera a feniltiohidantona (PTH)
do aminocido 1 e o restante da protena,
tornando o aminocido 2 o novo resduo
N-terminal (no exemplo uma serina, S);
Anlise cromatrogrfica do PTHaminocido e novo ciclo de reao com o
novo N-terminal da protena.

Sequenciadores automatizados fazem

todas as etapas, com capacidade
para realizar 30 ciclos por dia, a partir
de 100-200 picomoles de protena.

anlise cromatogrfica (troca inica ou fase reversa)

Quando uma protena possui mais de 20-30 resduos de aminocidos, no

possvel sequenci-la diretamente pelo mtodo de Edman.
Protena
Total 150 a.a

30 aa
sequncia obtida a partir da protena intacta

Para obter a sequncia completa de uma protena, necessrio sequenciar vrios peptdeos
da mesma protena, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, at haver sobreposio
de suas sequncias.
protena
inteira
peptdeos
mtodo A
peptdeos
mtodo B

Diferentes mtodos so utilizados para obter-se diferentes peptdeos da protena: A) enzimas

proteolticas, como tripsina (quebra em resduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em
resduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianognio (quebra em Met); e outros.

Sequenciamento de novo de protenas por espectrometria de

Para sequenciar
protenas preciso
obter o espectro MS/MS
de seus peptdeos.
hlio ou argnio

Isso significa 2 etapas

de MS acopladas.
Depois de fazer o MS
da molcula inteira,
esta fragmentada
dentro do aparelho por
coliso com gases.
Os fragmentos so
ento separados e
analisados
por
MS. os
A ligao peptdica se quebra formando fragmentos
tpicos,
como
ons b e y mostrados na figura acima, que tero massas diferentes de
acordo com o radical R de cada aminocido.

Espectro MS/MS do peptdeo

trptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.

AA Codes

Mono.

AA Codes

Mono.

Gly

57.021464

Asp

115.02694

Ala

71.037114

Gln

128.05858

Ser

87.032029

Lys

128.09496

Pro

97.052764

Glu

129.04259

Val

99.068414

Met

131.04048

Thr

101.04768

His

137.05891

Cys

103.00919

Phe

147.06841

Leu

113.08406

Arg

156.10111

Ile

113.08406

CMC

Asn

114.04293

Tyr

163.06333

Trp

186.07931

161.01467

Analiza-se o espectro
buscando diferenas de
m/z equivalentes a um
resduo de aminocido,
que permitem conhecer
a seqncia do
peptdeos

Sntese de peptdeos

Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004

H2N
bloq
1. DNA recombinante
1. Qumica: uso de reagente qumico para
ativar o cido carboxlico de um N-acilaminocido, o qual sofre o ataque nucleoflico
do grupo - amino de outro aminocido
- indicado para sequncias de at 20 aa.
- estereo-ismeros, purificao dos produtos
3. Biocatlise: reverso da protelise
- diminuio da atividade da gua no meio
reacional reverte a ao de enzimas
proteolticas
- termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc
- vantagens:, no forma misturas racmicas e
sub-produtos, condies brandas

COOH
bloq

Sntese de peptdeos
Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo - amino dos doadores de acila,
estvel ao cido trifluoroactico (TFA) e lbil a bases orgnicas todas as outras
carboxilas so protegidas por reagentes lbeis ao TFA e estveis a bases orgnicas
Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo - amino dos doadores de acila lbil ao
(TFA) todas as outras carboxilas so protegidas por reagentes estveis a este cido e
lbeis a cidos inorgnicos fortes ou hidrogenlise.

Sntese de peptdeos

Robert B. Merrifield Prmio Nobel em Qumica em 1984

Sntese de peptdeos

ELETROFORESE
ELETROFORESE
CONDIES QUE DETERMINAM A SEPARAO

1. pH / tampo

2. Suporte
- papel : corrente alta (calor)
uso para peptdeos e aminocidos

+
+
SUPORTE X pH MEIO

- poliacrilamida: protenas
ac. nucleicos
no desnaturante ou nativa
desnaturante e redutor
peso molecular
composio de subunidades
focalizao isoeltrica: PI
bidimensional
- agarose: cidos nuclicos
Imunoeletroforese
Protenas nativas

_
Reao de eletrlise da gua

Uso de tampo concentrado

Uso de indicador de pH como

marcador de corrida:
azul de bromofenol

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

+
persulfate

polyacrylamide

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

7 a 15% [acrilamida] maioria das protenas

[ ] mais baixas gel muito mole
suporte com agarose
Gradiente de acrilamida aumenta poder de
resoluo

Ponto Isoeltrico

Protena
Pepsina

< 1.0

Ovalbumina(galinha)

4.6

AlbuminaSrica(humana)

4.9

Tropomiosina

5.1

Insulina (bovina)

5.4

Fibrinognio (humano)

5.8

Globulina

155.000

6.6

Colgeno

330.000

6.6

Mioglobina(cavalo)
Hemoglobina (humana)
Ribonuclease A (bovina)

18.000
64.000

7.0
7.1
7.8

Citocromo
c (cavalo)

10.6

Histona (bovina)

10.8

Lisozima (galinha)

11.0

Salmina(salmon
)

12.1

Separao na
eletroforese nativa
influenciada pela carga,
massa e forma da
molcula

SDS (dodecil sulfato de sdio

+
2-mercaptoetanol

Efeitos do SDS
desnaturao uniformiza a forma
das protenas;

B
C
A

mascara a carga natural das

protenas no pH da corrida, fazendo
com que todas molculas migrem
para o ando;
facilita o efeito de redutores

SDS-PAGE
Salmonella tiphymurium

Determinao da massa molecular de protenas

Curva de calibrao de SDS-PAGE a 15%

Massa molecular (kD)

Mobilidade relativa =
distncia percorrida pela banda X
distncia percorrida pelo marcador da corrida

(-)

97.4
87.0

45.0

29.0

Mobilidade relativa (Rf)

(+)

21.0
12.5
6.5

Eletroforese focalizao isoeltrica

migrao atravs de um gradiente de pH
protenas focalizam nos seus P.I.

Anflitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados (patenteados)

Gel no tamponado polimerizado com anflitos
1 corrida: anflitos criam gradiente
2 corrida: amostras so aplicadas

_
3.0

Aps a corrida: pedaos do gel so

analisados quanto ao seu pH.
4.0

Aplicaes:

pH

-Determinao do PI

5.0

-Isoformas da mesma protena:

- glicosilao
- fosforilao
- mutaes pontuais

6.0

+
Marcadores de P.I. conhecidos

pH

Eletroforese Bidimensional
-

Origem

3
3.5
4
PI

4.5
5
5.5

10 9 8 7

PM x 103

1a.dimenso: focalizao isoeltrica

2a.dimenso: SDS PAGE (perpendicular a 1a.)

Protenas com a
mesma massa

PROTEOMA:

anlise simultnea de at 5.000 protenas

permite comparao de todas as protenas
expressas por uma clula em dois momentos
diferentes:
anlise do efeito de hormnios,
anlise do efeito de drogas;
estados fisiolgicos (desenvolvimento);
condies patolgicas diversas (vrus,
bactrias,etc.)

Protenas com mesmo pI

Eletroforese 2D de protenas totais

(proteoma) de Escherichia coli

Gel nativo:
sem fervura das amostras
pode ter SDS no gel de separao
Conformao nativa, oligomerizao
Zimogramas: estudos de enzimas, afinidade
Gel copolimerizado (gelatina, amido, etc)
Gel overlay (gel de agarose)
Protenas nativas ou renaturadas no gel por
remoo lenta do SDS por troca com detergente
no inico

Antgeno B do Echinococcus granulosus

Rhipicephalus microplus Cys-endopeptidase

Multmeros de subunidades de 8 kDa

Estrela et al, 2010
Comp. Biochem. Physiol

15% SDS-PAGE
Monteiro et al., 2011
PLoS Neglected Tropical Diseases

12% SDS-PAGE- copolimerizado com 0.1 % hemoglobina

- aps corrida, retirada do SDS troca por Triton X-100 (3h)
- incubao a pH 4,0, 18h/37 oC.

Urease de Canavalia ensiformis

(hexmero de 90 kDa)

Superoxide dismutases from Metarhizium. anisopliae

Ni2+ Cu2+ Zn2+ Hg2+

3% PAGE

Efeito de Cu2+ - precipitao

Follmer & Carlini, 2005
Arch. Biochem. Biophys.

8.5% non-denaturing gels

- atividade das SODs revelada Inibio da reduo do NBT em
presena de TEMED e riboflavina

Tolfo Bittencourt et al., 2004 Res. Microbiol

Mtodos imunoqumicos aplicados a protenas

estrutura e propriedades de imunoglobulinas
anticorpos policlonais e monoclonais: produo e purificao
imunodiagnstico: aglutinao X lise
imunoprecipitao: difuso em gel, imunoeletroforese
ELISA, Western blot
imunohistoqumica e imunofluorescncia

Anticorpos so imunoglobulinas.
Funo

Estrutura

Cadeia H (pesada) 50.000 d

Cadeia L (leve)
25.000 d

antgeno

Cadeia H

Cadeia L

Imunoglobulina
classe
IgG

Sub-classe
IgG1

ou

ou

IgG2

ou

IgG3

ou

IgG4

ou

ou

ou

IgM

ou

IgD

ou

IgE

IgA

IgA1
IgA2

Poro N-terminal das cadeias L e H

~ 120 aminocidos variveis
restante da cadeia constante

anticorpo

Complexo antgeno-anticorpo

Mecanismos
atravs dos quais
os anticorpos
executam as
funes de defesa:

- Neutralizao (Ag solveis)

- Opsonizao (Ag particulados)
- Imunecomplexo (todos Ags)

Produo de Anticorpos: imunizao ativa

Propagao clonal de linfcitos B ou plasmcitos

Um linfcito B sempre produzir
imunoglobulinas para o mesmo
antgeno, mas poder variar a
classe de anticorpos produzidos

Anticorpos policlonais versus Anticorpos monoclonais

H vrios determinante antignico ou epitopo em uma protena

- tamanho: 5 a 6 aminocidos
- podem ser sequenciais ou conformacionais

Produo de
Anticorpos
Monoclonais

Reconhecimento de
apenas um determinante
antignico
tipo nico de
imunoglobulina
Vantagens e desvantagens

Imunoprecipitao

Complexos Ag-Ac insolveis

- Precipitado mximo na
Zona de equivalncia
- Excesso de Ag ou de Ac
Fazem complexos solveis

Imunoprecipitao em gel de agarose

Imunodifuso dupla
Permite comparar antgenos e detectar determinantes
antignicos em comum

Identidade
total

Identidade
parcial

Ausncia de
identidade

Protenas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas

- Servem como ligantes em matrix de afinidade
- Servem como 2.ligantes em testes imunoenzimticos
Recombinant
Protein L

Native
Protein A

Recombinant
Protein A

Recombinant
Protein G

Protein
A/G

Source

Peptostreptococci

Staphylococcus
aureus

Bacillus

Streptococci

Bacillus

Molecular Weight

35,800

42,000

44,600

22,000

50,449

Number of Binding
Sites for IgG

Albumin Binding Site

no

no

no

no

no

Optimal Binding pH

7.5

8.2

8.2

5-8.2

Binds to

VL

Fc

Fc

Fc

Fc

bead

Imunobeads: adsoro complexo Ag:Ac

Ensaios Imunoenzimticos ou ELISA

cor
E

Ac 2.

ELISA
sandwich + 2.Ac

+ 1.Ac

+ Ag

+S

cor

placa

Ag

Abs (intensidade da cor)

Ac 1.

Concentrao do Ag ou Ac

Padronizao do ELISA

ELISA Competitivo adequado para identificao e

quantificao tanto do antgeno como do anticorpo.

(1)

(2)

Para a determinao de Ag, o Ag presente na amostra

compete com Ag marcado com uma enzima, para se ligar ao
Ac imobilizado. A cor desenvolvida na revelao
indiretamente proporcional concentrao de Ag na
amostra.
O Radioimunoensaio (RIA) baseia-se no mesmo
princpio, utilizando Ag marcado com um radioistopo para
competir com o Ag frio presente na amostra.

Variante para
pesquisa do Ac

- Quanto maior a concentrao do antgeno a ser medido, maior ser

o deslocamento do antgeno marcado, permitindo a quantificao.

Western blot
Anticorpo secundrio marcado com:
- enzima
- radioativo
- fluorescente

Imunofluorescncia:
-anticorpos marcados com diferentes fluorforos
vermelho (rodamina), verde (fluorescena)

GluR1 clusters in hippocampal cultured neurons

MAP2-(neurons) and GFAP-(astrocytes) positive

cells in hippocampal cell culture

Presynaptic terminals showned by immunostainig of

specifically presynaptic protein Synapsin in cultured
hippocampal neuron