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Cultura de Clulas

Discente: Maysa Yzabety da Silva Caldas


Orientador: Maria Rosa Quaresma Bonfim

O que cultura celular?


o processo pelo qual clulas so mantidas
vivas e em crescimento fora de seu tecido
original em condies controladas.
Conjunto de tcnicas que permite cultivar
ou manter clulas isoladas fora do
organismo onde existem, mantendo as
caractersticas prprias.

Como aplicar a cultura de clulas?

Breve histrico da cultura de clulas

O cultivo de clulas se iniciou no princpio do sculo XX com


Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912.

Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaes obtidas nas


observaes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de clulas
cardacas de embrio de galinha para o cultivo. Seus experimentos
foram muito importantes, pois com Carrel descobriu-se a necessidade
da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos.

Breve histrico da cultura de clulas

Em 1951, George Gey cultivou clulas de tecido tumoral humano


estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada at hoje em todo o
mundo.

O avano na cultura de clulas ocorreu, em grande parte, por


intermdio dos experimentos de Hayflick e Moorhead, em 1961,
considerados clssicos, nos quais eles utilizaram clulas de vida
finita.

Em 1962, Nakamura e colaboradores, no Japo, estabeleceram a


linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano
(Cercopithecus aethiops). Essa clula uma das poucas, na
atualidade, aprovadas para uso em produo de vacinas.

Tipos de cultura

Cultura primria

Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de


clulas oriundas de um fragmento de tecido obtido por
desagregao mecnica ou enzimtica. As clulas que
conseguirem sobreviver ao processo de desagregao e aderirem
garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daquele
tecido. Essas clulas possuem as caractersticas do tecido de
origem, podem crescer em cultura por um determinado perodo de
tempo e so denominadas clulas primrias.

Cultura secundria

Clulas derivadas de culturas primrias que esto sendo


cultivadas in vitro por algum tempo, mas no sofreram
transformao. Podem sofrer senescncia.

Linhagem celular estabelecida

Clulas que ainda no perderam as caractersticas do tecido de


origem, mas possuem alta proliferao. So muito utilizadas em
pesquisas, pois podem ser mantidas em cultura por um grande
perodo de tempo (quando comparado s clulas primrias) e
ainda guarda grande parte das caractersticas do tecido original.

Linhagem celular transformada

No momento em que as caractersticas genticas das clulas so


modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfolgica e
geneticamente ao tecido original e so ento chamadas clulas
transformadas. Tais clulas podem ser transformadas em cultura
utilizando-se substncias qumicas, vrus, etc.

Clulas aderentes e clulas no aderentes

As clulas aderentes so oriundas de tecidos duros e, por isso, so


dependentes de ancoragem, ou seja, necessitam de adeso a uma
superfcie de contato para que possam iniciar a sua proliferao.
Para as clulas aderentes, as garrafas de cultura devem possuir
uma carga negativa.

As clulas no aderentes podem ser cultivadas em suspenso no


meio e so derivadas de tecidos que no necessitam de ancoragem
para proliferar e sobreviver. Essa capacidade est restrita s
clulas hematopoiticas, s linhagens transformadas ou s clulas
de tecido tumoral.

Biossegurana

Biossegurana

Biossegurana (biosafety): utilizao de


princpios de conteno, tecnologias e
prticas que so implementadas para
prevenir a exposio involuntria a
agentes patognicos e toxinas, ou a sua
liberao acidental.

Alm do risco biolgico, um laboratrio de cultivo celular possui


os riscos:

Qumicos . lquidos combustveis, corantes txicos (azul de


Tripan, MTT, bis-benzimida), gases txicos;

Fsicos . calor, radiao, vibrao e frio.

Barreiras de conteno no
trabalho em cultura de clulas

Luvas

Gorro

Mscara

Jaleco

Sapato fechado

Realizar antissepsia das mos com lcool 70%

Infraestrutura
laboratorial

A organizao de um laboratrio voltado pesquisa com clulas


depende da sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo
trabalhar. De maneira geral, o laboratrio necessita dos seguintes
espaos:

rea para lavagem e esterilizao;

rea para preparo de meios;

rea para incubao e observao das culturas,

rea para manipulao assptica das culturas.

Equipamentos

Fluxo Laminar

Estufas de CO2

Estufa de secagem

Autoclave

Microscpio invertido

Centrfuga

Banho-maria

Freezer -80C

Container com Nitrognio

Limpeza, desinfeco e esterilizao

A superfcie da rea de trabalho deve sempre ser limpa, utilizandose lcool a 70% , uma vez por dia ou aps cada atividade;

A gua sanitria comercial (2% a 5% de cloro) , tambm, um bom


desinfetante quando diluda de 5 a 10 vezes,

O fluxo de ar, assim como a lmpada de ultravioleta devem ser


ligados trinta minutos antes do uso.

Controle microbiolgico de
ambientes e processos

As tcnicas asspticas reduzem a probabilidade de infeco;

A necessidade de manuteno da assepsia inclui uma srie de


procedimentos;

As culturas, assim como todos os resduos da manipulao,


devem ser descontaminadas, antes do descarte, em autoclave
durante uma hora a 121C,

O laboratrio deve possuir um programa rotineiro adequado de


controle de insetos e roedores.

Tcnicas e conceitos
para cultivo celular

Lavagem e preparo do material


para cultura de clulas

A vidraria utilizada para cultura de clulas deve ser exclusiva e processada


separadamente das demais;

Frascos muitos sujos, com resduos aderidos, devem ser lavados com soluo
sulfocrmica;

A esterilizao da vidraria em geral realizada por autoclavao sob presso


a 121C por 20 minutos,

A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120C, por


aproximadamente 6 horas.

Manuteno das culturas

Propagao

Para manter as clulas em


cultura necessrio utilizar
tcnicas bsicas que evitem
a morte celular dentro da
garrafa de cultivo.

O processo de renovao de
clulas de uma garrafa para
outra chamado passagem.

Para as clulas no aderentes, o


procedimento de passagem se
assemelha a uma diluio e basta
retirar clulas da garrafa de cultivo,
adicionando novo meio ao seu lugar;

As clulas aderentes possuem um


mtodo especfico para efetuar a sua
passagem, por se encontrarem
aderidas ao fundo da garrafa de
cultivo ( uso da Tripsina),

A dissociao de tecidos envolve a


dissociao da matriz.

Congelamento

Manter clulas congeladas significa


atrasar, em anos, quaisquer alteraes que
poderiam ocorrer quando em cultura. Tais
alteraes so dispensveis para os
laboratrios de cultura de clulas e os
grandes bancos mundiais fornecedores de
linhagens,

O procedimento mais utilizado no


congelamento celular o lento.

Descongelamento

O descongelamento geralmente
ocorre de forma rpida.
Simplesmente retira-se a ampola
do tanque de nitrognio lquido e
coloca-se ela em gua a 37 C
imediatamente,

Os procedimentos de
congelamento e
descongelamento so os mesmos
para as clulas aderentes e para
as no aderentes

Quantificao celular

Existem duas maneiras de se quantificar


clulas em cultura. Na forma direta ,
conta-se diretamente o nmero de clulas
presente na garrafa de cultivo; a forma
indireta feita por meio da quantificao
de determinadas estruturas celulares,
como protenas, ou pela medio do
metabolismo celular.

Viabilidade celular

Excluso por Azul de Tripan

Conceitos bsicos e
controle da qualidade
de cultivos celulares

Cariotipagem

O mtodo de cariotipagem um
exame citogentico que verifica o
estado do caritipo das clulas.
Sua anlise feita por meio de
vrias coloraes que evidenciam
partes dos cromossomos,

Para a cariotipagem, necessria


a interrupo da proliferao
celular das clulas em cultivo no
momento da metfase utilizandose a colchicina.

Anlise de isoenzimas

Para utilizar isoenzimas como


forma de identificao celular,
deve- se obter um perfil
enzimtico chamado zimograma,
no qual as enzimas correm em um
gel de eletroforese e seu perfil de
corrida avaliado por tcnicas
histoqumicas

DNA fingerprinting

a principal ferramenta
utilizada para a identificao
exata e precisa de determinada
linhagem celular. uma tcnica
muito utilizada para detectar a
contaminao cruzada entre
duas clulas em cultura.

Ciclo celular e fases de


crescimento celular

Ciclo celular

A anlise do ciclo celular o


primeiro passo para a compreenso
das vias de ativao e proliferao
das clulas, sendo necessrio o
conhecimento das fases do ciclo
celular.

Fases do crescimento celular

Fase lag: Perodo de adaptao no qual no ocorre proliferao aps


adio das clulas ao meio de cultivo.

Fase log: Fase logartmica ou exponencial, perodo no qual a


multiplicao celular mxima e constante.

Fase estacionria ou plateau: A velocidade de crescimento diminui, o


nmero de morte celular tende a ser equivalente ao nmero de clulas
novas, e a atividade metablica decresce.

Fase de declnio ou morte celular: H reduo drstica do nmero de


clulas e o nmero de clulas mortas excede o de clulas novas.

Principais agentes
contaminantes em
cultura de clulas

Contaminao bacteriana

As bactrias so organismos procariontes com capacidade de


proliferao muito rpida e que, na maioria das vezes, conseguem
crescer em qualquer condio.

Contaminao por micoplasmas

Micoplasmas so contaminantes comuns de culturas de clulas,


microorganismos procariotos desprovidos de parede celular que
possuem uma membrana lipdica em bicamadas.

Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de colorao


fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA.

Contaminao por leveduras

Leveduras so fungos unicelulares muito comuns em cultura.


Caracterizam-se por serem menores do que as clulas animais.
Multiplicam-se principalmente por brotamento.

Meios de cultura e
solues utilizadas em
cultivos celulares

Conjunto de fatores capazes de


reproduzir um microambiente capaz
de simular as condies fisiolgicas
de um organismo multicelular em
seu mbito tridimensional, o que nos
permite o cultivo de clulas; A
escolha do meio de cultivo depende
do tipo celular a ser cultivado.

Controle da qualidade da gua e


reagentes

Para evitar contaminao por compostos orgnicos volteis, que


permanecem aps a destilao e que inibem o crescimento das
culturas, deve-se utilizar gua classificada como ultrapura, que
consiste num sistema de purificao por filtrao com carvo
ativo, colunas de troca inica e filtros de acetato de celulose.

Soro fetal

Apesar da sua constituio qumica, os meios de cultivo so


usualmente suplementados com 5% a 20% de soro, pois as clulas
em cultura tambm necessitam de fatores de crescimento,
hormnios, protenas e peptdeos, nucleosdeos, lipdeos e
inibidores que podem ser supridos por esse fluido animal.

Sistema de filtrao

Para substncias orgnicas que no resistem ao processo de


esterilizao por autoclave, convm dispor-se de dispositivo para
filtrao por membranas.

Assim, utiliza-se o processo de filtrao, que consiste na


passagem de lquido por membrana filtrante com pequenos poros
que impedem a passagem de microrganismos.

Vantagens do cultivo de clulas in


vitro

Estudo do comportamento da clulas em condies controladas - sem a


influncia animal.

Obteno de clulas com boa homogeneidade e bem caracterizadas;

Reprodutibilidade dos experimentos

Reduo do uso de animais

Exposio a frmacos em concentraes definidas (farmacocintica)

Economia de animais, reagentes, tempo, etc.

Possibilidade de no realizar experimentos em seres humanos

Limitaes do cultivo celular in vitro

Mo de obra especializada e requer ambiente controlado.

Uso de produtos de origem animal instabilidade dos lotes.

Custo elevado

Custo do esforo e material (baixa quantidade de clulas produzidas para o


material e esforo gasto);

Perda de caractersticas fenotpicas;

Necessidade do uso de marcadores devido perda de caractersticas fenotpicas;

Instabilidade gentica

Instabilidade das clulas (sobretudo em linhagens celulares imortais).

Referencias bibliogrficas

MANUTENO de linhagens de clulas animais. In: FUNDAO


OSWALDO CRUZ. Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz,
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MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P.; CASTILHO, L. R. Tecnologia do


cultivo de clulas animais: de biofrmacos terapia gnica. So Paulo: Rocca,
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