RNA

(RIBOSOMAL)

El cido ribonucleico ribosmico (ARNr) es el

componente de RNA del ribosoma, y es esencial
para la sntesis de protenas en todos los
organismos
vivos.
Comprende
el
material
predominante en el ribosoma, que es aprox. 60%
rRNA y 40% protena por peso. Los ribosomas
contienen dos rRNAs principales y 50 o ms
protenas.
Los rRNAs LSU y SSU se encuentran dentro de las
grandes y pequeas subunidades ribosomales,
respectivamente. El rRNA LSU acta como una
ribozima, catalizando la formacin del enlace
peptdico. secuencias del rRNA son ampliamente
utilizadas para la elaboracin de relaciones
evolutivas entre organismos, ya que son de origen
antiguo y se encuentran en todas las formas
conocidas de vida.

 Dentro del ribosoma los ribosomas RNAs forman

dos subunidades, la subunidad grande (LSU) y la
subunidad pequea (SSU). mRNA se intercala entre
las subunidades pequeas y grandes y el ribosoma
cataliza la formacin de un enlace peptdico entre
los 2 aminocidos que se encuentran en la rRNA.
El ribosoma tambin tiene 3 sitios de Unin,
llamados sitios A, P, y s E. El sitio A en el ribosoma
se une a un aminoacil-tRNA (un tRNA enlazado a
un aminocido).

 Los ribosomas procariticos y eucariticos

pueden dividirse en dos subunidades (S en 16S
representa unidades Svedberg), nt = longitud en
nucletidos de los rRNAs respectivos, para
ejemplares de la especie E. coli (clula procariota)
y humanos (eucariotas):
Type

Size

Large subunit(rRNAs)

Small subunit(rRNA)

prokaryotic

70S

50S(5S: 120 nt,23S: 2906

nt)

30S(16S: 1542 nt)

eukaryotic

80S

60S(5S: 121 nt,[1]5.8S: 156

nt,[2]28S: 5070 nt[3])

40S (18S: 1869 nt[4])

EUCARIOTAS
En cambio, las eucariotas tienen generalmente muchas
copias de los genes del rRNA organizados en
repeticiones en tndem; en los seres humanos
aproximadamente 400 repeticiones estn presentes en
cinco grupos (en los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22).
Debido a su especial estructura y comportamiento de la
transcripcin, racimos de gene del rRNA son
comnmente llamados "ADN ribosomal" (tenga en
cuenta que el trmino parece implicar que los ribosomas
contienen ADN, que no es el caso).

RNAr
Simbolizado como rRNA. Son los
componentes estructurales de los
ribosomas.
En
procariontes
se
distinguen
molculas de rRNA 5s, 16s y 23s; en
eucariontes se encuentran molculas
de rRNA de 5s, 5.8s, 18s y 28s.

 El ARN ribosmico (ARNr) 16S es la

macromolcula ms ampliamente utilizada
en estudios de filogenia y taxonoma
bacterianas.

Su aplicacin como cronmetro molecular

fue propuesta por Carl Woese (Universidad
de Illinois) a principios de la dcada de
1970

 Los estudios de Carl Woese originaron la

divisin de los procariotas en dos
grupos
o
reinos:
Eubacteria
y
Archaeobacteria.
Woese introdujo el trmino dominio
para sustituir al reino como categora
taxonmica de rango superior, y
distribuy a los organismos celulares en
tres dominios: Bacteria, Archaea y
Eukarya, el ltimo de los cuales engloba
a todos los seres eucariotas

 Los ARNr 16S pueden caracterizarse

en trminos de secuencia parcial,
mediante el mtodo de catalogacin
de oligonucletidos, utilizado en los
estudios pioneros de Woese.
Siguiendo esta tcnica, el ARNr 16S
marcado in vivo, y purificado, se
trata con la enzima ribonucleasa T1.

 Ribosomas
Son
orgnulos
complejos,
altamente
especializados, que utilizan los organismos
para el complicado proceso de sntesis de
protenas.

 Operones
se utiliza como una unidad gentica
funcional formada por un grupo o
complejo de genescapaces de
ejercer una regulacin de su propia
expresin por medio de los sustratos
con
los
que
interaccionan
lasprotenascodificadas
por
sus
genes

Este complejo est formado por genes

estructurales que codifican para la
sntesis
de
protenas
(generalmenteenzimas),
que
participan en vas metablicas cuya
expresin generalmente est regulada
por otros 3 factores de control.

ARNr 16S

Es un polirribonucletido de aproximadamente 1.500 nt, codificado

por el gen rrs, tambin denominado ADN ribosomal 16S (ADNr
16S), a partir de cuya secuencia se puede obtener informacin
filogentica y taxonmica. Como cualquier secuencia de
nucletidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una
estructura secundaria, caracterizada por la presencia de
segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena
sencilla.

 Los ARNr SSU se encuentran altamente conservados,

presentando regiones comunes a todos los organismos, pero
contienen adems variaciones que se concentran en zonas
especficas.
El anlisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos
filogenticos revel un hecho adicional de gran importancia
prctica: la presencia de una o ms secuencias caractersticas
que se denominan oligonucletidos firma. Se trata de
secuencias especficas cortas que aparecen en todos (o en la
mayor parte de) los miembros de un determinado grupo
filogentico, y nunca (o slo raramente) estn presentes en
otros grupos, incluidos los ms prximos. Por ello, los
oligonucletios firma pueden utilizarse para ubicar a cada
bacteria dentro de su propio grupo.

 El nmero de copias del opern ribosmico por genoma bacteriano vara

considerablemente, de 1 a 15, siendo relativamente constante a nivel de
especie, gnero e incluso familia7 (tabla 1). Entre las copias de los ARNr
16S codificadas por un mismo genoma se ha detectado un cierto grado
de heterogeneidad (denominada microheterogeneidad).
El anlisis de 14 genomas bacterianos, cuya secuencia completa se
encuentra disponible, indic una divergencia mxima del 1,23%, que
corresponde a los ADNr
16S de Escherichia coli (tabla 1). Adems, diferentes autores encontraron
variabilidad intragenmica entre los ADNr 16S de otras bacterias de
inters clnico, cuyo genoma an no ha sido secuenciado. Destaca la
elevada heterogeneidad (1,43%) detectada entre las 4 copias del ADNr
16S presentes en la cepa clnica ADV 360.1 de Veillonella8. Obviamente,
la variabilidad intragenmica, tiene importantes implicaciones prcticas
para la identificacin. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, todas
las copias del ADNr 16S de un organismos son idnticas o casi idnticas.

Caractersticas relevantes del ARNr 16S

para su utilizacin como herramienta
filogentica y taxonmica

Aunque existen cronmetros moleculares alternativos al ARNr

16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarle. De
hecho, esta macromolcula presenta una serie de
caractersticas, en base a las cuales fue considerado por Woese
como cronmetro molecular definitivo:

1. Se trata de una molcula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales.
Constituye, por tanto, una diana universal para su identificacin.
2. Su estructura y funcin han permanecido constantes durante un tiempo muy
prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente
cambios aleatorios.
3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar
informacin acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los
ARNr 18S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin
embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no slo los organismos ms
alejados, sino
tambin los ms prximos.
4. El tamao relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las
fluctuaciones estadsticas.
5. La conservacin en estructura secundaria puede servir de ayuda en las
comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.
6. Dado que resulta relativamente fcil secuenciar los ADNr 16S existen bases de
datos amplias, en continuo crecimiento.

Aspectos metodolgicos de la identificacin bacteriana

mediante secuenciacin del ADNr 16S
El mtodo molecular de identificacin bacteriana mediante
secuenciacin del ADNr 16S incluye tres etapas:
a) amplificacin del gen a partir de la muestra apropiada;
b) determinacin de la secuencia de nucletidos.
c) anlisis de la secuencia.

Amplificacin

La amplificacin del ADNr 16S se consigue en un

termociclador, gracias a la reaccin en cadena de la
polimerasa
(PCR).
Como
sustrato
se
utiliza
normalmente ADN purificado a partir de un cultivo puro
del agente
patgeno. Alternativamente, el ADN podr obtenerse
directamente de la muestra clnica, en el caso de
bacterias fastidiosas o no cultivables, cuando aquella
proceda de rganos o tejidos normalmente estriles.
Para la extraccin del ADN bacteriano existen
protocolos generales12, pero pueden requerirse
modificaciones, dependiendo de la bacteria. Adems, la
amplificacin tambin puede conseguirse directamente
a partir de una colonia aislada o un cultivo lquido de la
bacteria de inters, o incluso a partir de una muestra
clnica,
simplificando
significativamente
la
identificacin, al evitar el laborioso proceso de
extraccin del ADN.

Oligonucletidos
iniciadores
Para la amplificacin del ADNr 16S, las regiones
conservadas facilitan el diseo de
oligonucletidos, se utilizan iniciadores
diseados en base a secuencias conservadas
prximas a los extremos 5 y 3 del gen, que
originan amplicones de 1.500 pb.
Se utilizan oligonucletidos que permiten la
amplificacin de fragmentos de menor tamao,
las 500 pb corresponden al extremo 5 del gen, en
cualquier caso (electroforesis).

Secuenciacin del amplicon

Se llevan a cabo las reacciones de secuenciacin y el anlisis

de los productos por electroforesis, y utiliza un nico
iniciador por reaccin y terminadores marcados con
fluorocromos , que interrumpen la sntesis de manera
aleatoria, y facilitarn la deteccin de los fragmentos .

El nmero de bases generadas por un secuenciador

automtico es de 500 a 900, Por ello, para la secuenciacin
de las dos cadenas del ADNr 16S completo, son necesarios
de 8 a 4 iniciadores, dos de los cuales podrn ser los mismos
utilizados en la amplificacin.

la secuenciacin de una cadena del amplicn puede conducir

a una correcta identificacin ,la calidad de la secuencia es
ptima cuando la comparacin de ambas cadenas se utiliza
para la correccin de errores.
La mayor variabilidad se concentra en las primeras 500
bases, correspondientes al extremo 5, para la identificacin
de un aislado clnico, necesitndo solo 2 iniciadores11,13-15,
la secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S completo,
ser necesaria a la hora de identificar nuevos patgenos.

Anlisis de la secuencia
La comparacin de la secuencia del ADNr 16S con las
bases de datos. Permite la comparacin de
secuencias.
En octubre de 2003 contena ms de 78.000
secuencias de ADNr 16S, que son alineadas, teniendo
en cuenta la estructura secundaria de la molcula. La
base de datos RIDOM, se limita tambin a secuencias
de
ADNr,
centrndose
en
microorganismos
patgenos.
Finalmentese
construye
un
rbol
filogentico, que refleja, de forma esquemtica, el
grado de parentesco gentico entre las bacterias
comparadas.

Sistemas comerciales
MicroSeq500, diseado para la identificacin rpida y
correcta de bacterias patgenas. Este sistema utiliza un par
de oligonucletidos que permiten amplificar un fragmento
de 527-bp correspondiente al extremo 5 del ADNr 16S. Se
trata de una versin simplificada del MicroSeq 16S rRNA
slo requiere dos iniciadores para la secuenciacin de
ambas cadenas, reduciendo el coste y el trabajo, el sistema
incluye una base de datos para determinar el gnero y la
especie del aislado. Adems, el software permite exportar
las secuencias que podrn ser comparadas con otras bases
de datos, e incluye herramientas para el anlisis
filogentico.

Aplicaciones de la secuenciacin
del ARNr 16S
en el diagnstico microbiolgico
La identificacin basada en la secuenciacin del
gen que codifica el ARNr 16S en los laboratorios
clnicos se centra en cepas cuya identificacin
por mtodos fenotpicos resulta imposible, difcil o
requiere mucho tiempo, incluyendo los siguientes
casos:

 1. Bacterias no cultivables presentes en muestras

clnicas.
2. Bacterias cuyas caractersticas bioqumicas no se
adaptan a las de ningn gnero o especie reconocido.
3. Bacterias para las cuales la caracterizacin
fenotpica sea sustancialmente deficiente.
4. Bacterias fastidiosas, a consecuencia de sus
requerimientos nutricionales.
5. Bacterias de crecimiento lento, que retrasa
considerablemente la identificacin convencional .

 Ejemplo:
En 1980, pacientes infectados por VIH, manifestaron
angiomatosis, con lesiones en la piel que recordaban a
las caractersticas del sarcoma de Kaposi.

Estas lesiones contenan

grupos de bacilos
pleomrficos, y se denomin angiomatosis bacilar16,
se utiliz por primera vez el ADNr 16S para la
identificacin, independiente de cultivo, de un agente
patgeno17.
El ADNr 16S del agente causal de la angiomatosis
bacilar se amplific a partir de tejido infectado,
utilizando oligonucletidos deducidos en base a
regiones conservadas, comunes a todas las bacterias.
El anlisis de la secuencia amplificada revel una
nueva bacteria, estrechamente relacionada con
Rochalimaea (despus Bartonella) quintana.

TAMBIEN:
Se han identificado bacterias patgenas
presentes en el lquido cefalorraqudeo
20,21, lquido sinovial 22, vlvulas
cardacas23 y sangre24-26

Actualmente:
La aplicacin ms importantes del ADNr 16S es la
identificacin de micobacterias no tuberculosas,
cuya incidencia ha aumentado,asociada a la
pandemia del sida.

El mtodo
de identificacin de estas
micobacterias
se
basa
en
caractersticas
fenotpicas (pruebas bioqumicas, produccin de
pigmento, fisiologa, y morfologa de las colonias),
la
determinacin
requiere
un
tiempo
considerable, como consecuencia del crecimiento
lento de estas bacterias en medios.

Sistema MicroSeq500:
Identificacin de bacterias corineformes.
Tanget al14 analizaron un total de 52 aislados, y
encontraron que a nivel de gnero los resultados de la
identificacin por secuenciacin eran concordantes con
los obtenidos utilizando criterios fenotpicos.
A nivel de especie, la identificacin por secuenciacin
fue ms fiable en las dos especies de Corynebacterium
con mayor relevancia clnica: C. diphteriae y C.
jeikeium. El tiempo requerido fue inferior a 24 h.

Ejemplo de aplicacin a la
identificacin de bacterias:
Sistema MicroSeq500, identificacin de 37 aislados
bacteriano incluan bacterias aerobias grampositivas
-gramnegativas y especies del gnero Mycobacterium,
identificadas por mtodos fenotpicos. El 81,1% de los
aislados fueron correctas, y el 13,5% incorrectas y en
el 5,4% (2 de 37), de especie.
En 5 casos, la identificacin errnea se debi a la
ausencia de las secuencias ADNr 16S de las bacterias
correctas en la base de datos del sistema
MicroSeq500

 Conclusin
La secuenciacin del ADNr 16S constituye un
mtodo rpido y eficaz de identificacin
bacteriana, del cual puede beneficiarse la
microbiologa clnica, al igual que otras ramas de
la microbiologa. A medida que los recursos
tcnicos aumentan, el precio se hace ms
competitivo, por lo que probablemente su
utilizacin para la identificacin sistemtica de
bacterias patgenas ser slo cuestin de
tiempo.