Estudios moleculares y funcionales en

clulas mononucleares de pacientes con

Tuberculosis pulmonar, estimuladas in
vitro con Mycobacterium tuberculosis y
tratadas
con
Cortisol
y/o
Dehidroepiandrosterona

Lic. Vernica V. Bozza

Directora: Dra. Mara Luisa Bay
Instituto de Inmunologa, Facultad de Ciencias Mdicas, UNR

Por que investigar sobre Tuberculosis?

Es la 1 causa de mortalidad debido a un
agente bacteriano.
1/3 de la poblacin mundial se encuentra
afectada.
Mueren 4.900 personas por da

Esta situacin es equivalente a ms de 10 Boeing 747

llenos de personas muriendo por da a causa de esta
crisis global de salud
Nature immunology, vol 4, N 10 octubre,2003.

Agente causal:
Mycobacterium
tuberculosis

Bacilo cido-alcohol
resistente

Tuberculosis
Principal va de transmisin:
Aerobio estricto y de vida
intracelular

AREA

Mayor incidencia
de TB pulmonar

Eventos cronolgicos en la
patognesis de la tuberculosis:
Inhalacin
del M. tuberculosis
Eliminacin
del patgeno

Estabilizacin
(latencia)

Complejo
primario

Infeccin
localizada

Diseminacin
del M. tuberculosis

Estabilizacin
(latencia)
Reactivacin
(TBC secundaria)

Infeccin
aguda

Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:

CPA
NK

RIN

M
IL-12
Th

IFN-

Th1
IL-2

T
citotxico

RIO

Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:

CPA
NK

RIN

M
IL-12

RIO

Th

IFN-
TNF-

Th1
T
citotxico

IL-2

Granulom
a

EJE HIPOTALMICO-PITUITARIOADRENAL

Optimizan el curso de respuestas biolgicas agudas

Sostenido

GC

apoptosis de linfocitos

Inhiben la sntesis de citocinas Th1

Inhiben la respuesta inflamatoria favoreciendo

la actividad de linfocitos Th2

Esteroide sintetizado fundamentalmente en

corteza suprarrenal y SNC

DHE
A

Facilita el patrn Th1

En humanos muchas enfermedades caracterizadas por

inflamacin crnica presentan bajos niveles sricos de
DHEA o DHEA-S

OBJETIVO GENERAL DE LA
LNEA DE TRABAJO
Estudiar los mecanismos inherentes a la interaccin
inmunoendcrina en pacientes con tuberculosis de
distinta severidad, y convivientes ntimos no enfermos
de estos pacientes.

MUESTRA
S
PACIENTES:
Enfermos con diagnstico de TBC pulmonar, basados en
criterios clnicos y radiolgicos e identificacin de bacilos
cido-alcohol resistentes en el esputo
CLASIFICACIN:
Leves: pacientes con un nico lbulo
involucrado sin cavidades visibles
Moderados: pacientes que presenten
compromiso unilateral de 2 o ms lbulos y las cavidades,
de hallarse presentes, no excedan un dimetro total de 4
cm
Severos: enfermedad bilateral con afectacin
masiva y cavidades mltiples

GRUPO CONTROL:
Muestras provenientes de individuos sanos similares
en edad y sexo a los pacientes.

Tanto las muestras de los pacientes como las de los

controles se analizaron en forma simultnea.

Se excluyen del estudio aquellos sujetos que:

Presenten co-infeccin con HIV.

Hayan iniciado el tratamiento antituberculoso.

Presenten patologas con compromiso directo de

la glndula suprarrenal.

Presenten patologas que involucren los ejes

hipotlamo-hipfiso-tiroideo y gonadal.

Padezcan patologas que requieran del consumo

de drogas corticosteroideas, inmunosupresoras
o inmunomoduladoras.

Muestra

Clulas

Obtener
sobrenadantes
para dosar
citocinas

Tratamientos

Evaluar la
blastognesis

TRATAMIENTOS
Cortisol (Gc)

Dehidroepiandrosterona(DHEA)

10-6 Molar
10-7 Molar

10-7 Molar
10-8 Molar
10-9 Molar
10-10 Molar

Sonicado de Mycobacterium tuberculosis,

concentracin: 8 g/ml (Tso)
Concanavalina A, concentracin: 2,5g/ml (Con A)

Basal

TSO

D 10-7

GC 10

GC 10

-6

-7

D 10-8

D 10-9

D 10-10

D 10-7

D 10-8

D 10-9

GC 10-6

GC 10-6

D 10-10

GC 10-6

GC 10-6

D 10-7

D 10-8

D 10-9

D 10-10

GC 10-7

GC 10-7

GC 10-7

GC 10-7

Los sobrenadantes se levantaron a las 36 hs y 4 das de cultivo

Se fraccionaron y congelaron para la posterior determinacin
de las citocinas

Resultados Previos:

Scandinavian Journal of Immunology 60, 639

646, 2004

Tratamiento

Grupos
Controles

Leves

Moderados

Severos

Tso

12748
(783920834)

2571
(147411049)

6487
(1593-16439)

4243
(6007356)

Tso +
Cortisol 10-6
M

2571
(13338376)*

881
(442-7857)

1135
(469-4620)*

1826
(3593563)*

Tso +
Cortisol 10-7
M

8794
(325613994)

1496
(11243611)

3509
(794-6380)

2791
(49812907)

Difieren de Controles, p<0,04

*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10 -6
M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).

Tratamiento

Grupos
Controles

Leves

Moderados

Severos

12748
(7839-20834)

2571
(1474-11048)

6486
(1592-16439)

4243
(600-7356)

Tso +
2570
-6
Cortisol 10 M (1333-8376) *

880
(441-7857)

1135
(469-4620) *

1826
(359-3563) *

+ DHEA 10-7 M

3219
(840-9486)

809
(554-4881)

1725
(488-5533)

1580
(449-4314)

+ DHEA 10-8 M

2675
(1034-8857)

906
(471-7925)

1122
(512-4785)

1669
(419-4742)

+DHEA 10-9 M

2793
(755-9084)

760
(490-5284)

890
(552-6847)

1831
(467-4496)

+ DHEA 10-10
M

2217
(822-8990)

809
(498-5812)

895
(713-5942)

2166
(464-3070)

Tso

Difieren de Controles, p<0,04

*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10 -6
M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).

1- Conocer si las modificaciones observadas en la

respuesta inmune especfica de las CPM frente a TSO, por

el agregado de Cortisol y/o DHEA, se encontraran
asociadas a un patrn diferencial en el proceso de muerte
celular programada y analizar los mecanismos implicados
en este proceso.

Basal

TSO

GC 10

-6

GC 10-6
solo

GC 10-7
solo

D 10-7

D 10-8

D 10-7
sola

D 10-9

D 10-7

D 10-8

D 10-9

GC 10-6

GC 10-6

GC 10-6

Determinacin de los niveles de

apoptosis por citometra de flujo

Anexina V/IP
(24 Horas de cultivo)

Hipodiploida (IP)
(4 das de cultivo)

Anexina V/IP

Hipodiploida (IP)
cultivo)

Clulas
apoptticas

(4 das de

Resultados Previos en Plasma:

Los pacientes
TB
presentaban:
Niveles de Cortisol

Niveles de DHEA

Niveles de IFN-
Niveles de IL-10
Niveles de TGF-
Niveles de IL-6

CONVIVIENTES:
Personas que viven con un enfermo diagnosticado y
con esputo positivo; sin sintomatologa, RX normal y
sin trastornos endcrinos

Tanto las muestras de los pacientes como las de los

convivientes y controles se analizaron en forma
simultnea

2- Analizar el perfil de citocinas (IFN-, TGF-, IL-10,

IL-6 y TNF-) producidas en la respuesta inmune
especfica de CPM de pacientes y de convivientes
ntimos; as como los niveles plasmticos de los
mencionados mediadores, y de Cortisol y DHEA en los
distintos grupos de estudio

Determinacin de los niveles de

citocinas en sobrenadantes de cultivo:
IFN-
TNF-

24 Hs

IL-6

36 Hs

IL-10

4 Das

TGF-
Las determinaciones se realizarn por ELISA, utilizando
kits comerciales

Resultados Previos:
Los pacientes
TB
presentaban:
CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO:
(VS. CONTROL)

En la produccin de IFN-

CULTIVOS ESTIMULADOS
CON TSO + GC 10-6 M: (VS.
CULTIVOS ESTIMULADOS)

En la produccin de IFN-

En la produccin de TGF-

= En la produccin de TGF-

= En la produccin de IL-10

= En la produccin de IL-10

Lnea celular adrenal NCI-H295-R

Adaptacin adherente de la lnea original NCI-H295 que crece
en suspensin.

Se originaron a partir de un adenocarcinoma adrenal

proveniente de una mujer de edad media de raza negra.

Conservan la capacidad de respuesta a estmulos fisiolgicos
produciendo todos los esteroides adrenales.

Produccin porcentual de DHEA en sobrenadantes de cultivos de

clulas NCI-H295-R, adicionadas con pool de sobrenadantes de
CPM de pacientes tuberculosos y controles sanos con o sin el
agregado de TSO.

4-

Investigar qu mediador(es) secretados por las

clulas perifricas mononucleares (estimuladas o no
con TSO) estaran implicados en la inhibicin de la
sntesis de DHEA por parte de la lnea celular
adrenal humana NCI-H295-R.

Cultivo de Clulas Perifricas Mononucleares con y sin

el agregado de TSO
Recoleccin de sobrenadantes de 24, 36 hs
y 4 das de cultivo
Adicin de los sobrenadantes de las CPM a la
lnea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el
Sobrenadante de la lnea adrenal

Cuantificacin de DHEA y Cortisol

Cultivo de Clulas Perifricas Mononucleares con y sin

el agregado de TSO
Recoleccin de sobrenadantes de 24, 36 hs
y 4 das de cultivo
Adicin de los sobrenadantes de las CPM a la
lnea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el
Sobrenadante de la lnea adrenal

Cuantificacin de DHEA-S y Cortisol

Adici
n de
antiTGF-

Muestra

HEMOGRAMA
POBLACIONE
S

Clulas

Obtener
sobrenadantes
para dosar
citocinas

Obtener
sobrenadantes
para exp. con la
lnea adrenal

Obtener clulas
para estudiar
apoptosis

Tratamientos

Evaluar la
blastognesis