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Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Cromatografia

Lquida (HPLC) e Espectrometria de


Absoro Atmica em Anlises
Toxicolgicas

Disciplina: Toxicologia Geral

CROMATOGRAFIA
A Cromatografia uma tcnica analtica onde os
componentes a serem separados so distribudos entre uma
fase mvel e uma fase estacionria.
CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
Cromatografia

Planar

Coluna

Gasosa

Lquida

Camada
delgada

Papel

CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA


GC - GAS CHROMATOGRAPHY
Fase mvel : gs de arraste (hlio, hidrognio,
nitrognio)

Fase estacionria: coluna cromatogrfica


- Substncias que podem ser analisadas por GC:
gases, substncias volteis e termicamente estveis.
Exemplos: etanol, metanol, cocana, tolueno,

benzeno, anfetaminas, praguicidas.

ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE GC
5

3
1

1) Fonte de gs de arraste em um cilindro de


alta presso - A escolha do gs de arraste (fase
mvel) depende de certos fatores como preo,
disponibilidade, pureza e tipo de detector
utilizado. Tambm deve ser um gs inerte.
Associado a fonte de gs esto os reguladores de
presso e os medidores de vazo que permitem
controlar e monitorar o escoamento do gs de
arraste: a eficincia da tcnica varia com a vazo
do gs (fluxo).

2) Sistema de injeo de amostra - A amostra


lquida introduzida com a ajuda de uma
microseringa de vidro. A agulha penetra uma
borracha de silicone que um septo auto-selante.
A utilizao da seringa, de modo ideal, permite
uma reprodutibilidade da tcnica. A temperatura
do injetor deve ser tal que o lquido amostral seja
rapidamente vaporizado sem haver decomposio
trmica (prximo ao ponto de ebulio do
componente menos voltil). Temperaturas comuns
de anlise so da ordem de 200-300C.

2) Sistema de injeo de amostra

split

splitless

3)

Coluna: A separao efetiva dos componentes da


amostra realizada na coluna cromatogrfica onde o tipo
e a quantidade da fase estacionria so fatores
importantes para se ter a eficincia desejada.
Coluna cromatogrfica

gs

gs

gs

DETECTOR

3)

Coluna:

De acordo com a natureza da fase estacionria,


possvel dividir-se a cromatografia em fase gasosa em:

A) Cromatografia gs-lquido (CGL) ou partio : a fase


estacionria uma pelcula delgada lquida no-voltil a qual
recobre um slido inerte denominado suporte. A base para a
separao cromatogrfica a distribuio da amostra dentro e
fora desta pelcula, ou seja, a partio da amostra entre a fase
mvel e a fase estacionria lquida.
B) Cromatografia gs-slido (CGS) ou adsoro : a fase
estacionria um slido de grande rea superficial, usualmente
um adsorvente como carvo vegetal, slica-gel ou peneira
molecular. Empregado na separao de gases como nitrognio,
oxignio, monxido de carbono, etc.

3) Coluna:
Tipos de coluna:
- Empacotada
- Capilar
Em colunas capilares temos uma maior eficincia,
uma melhor resoluo cromatogrfica e um tempo
de anlise menor.

3) Coluna:
Eficincia da coluna pode ser calculada pelo nmero de pratos
tericos (N):
N = 16 (TR / Wb)2 = 5,545 (TR / Wh) 2
TR

= tempo de
reteno
Wb = largura da base
do pico
Wh = largura a meia
altura do pico
Um prato terico definido como sendo um equilbrio de
distribuio do soluto entre as duas fases; quanto maior o
valor de N, mais equilbrios existiro e a separao ser
maximizada.

3) Coluna:
Os parmetros operacionais de uma coluna podem ser
melhor avaliados por seu efeito sobre a altura equivalente a
um prato terico (AEPT ou H)que corresponde razo entre o
comprimento da coluna, L (em cm) e o nmero de pratos
tericos, N.
H = AEPT = L /N
Portanto, H o comprimento necessrio de uma coluna para
gerar um prato terico; quanto maior N, menor ser H e mais
eficiente ser a coluna.

3) Coluna:
Resoluo:
A Resoluo (R) uma medida quantitativa da
separao de dois picos consecutivos, sendo determinada
por dois fatores: TR e Wb.

R = 2 TR / Wb1 + Wb2

3) Coluna:
Resoluo:

4) Forno:
-Temperatura
-Anlise isotrmica: quando a anlise em cromatografia em fase gasosa realizada com forco mantido temperatura constante desde o incio
at o final.
-Temperatura programada: a temperatura muda durante o decorrer da anlise

A) Balstico B) Linear C) Multilinear

4) Forno:

4) Forno:

5) Detectores:
A) Detector de Ionizao de Chama (FID)
B) Detector de Condutividade Trmica (TCD)
C) Detector de Nitrognio-Fsforo (NPD)
D) Detector de Captura de Eltrons (ECD)
Obs: Em geral utiliza-se temperaturas mais elevadas no detector do que no forno, para evitar condensao de substncias no detector (contaminao).

5) Detectores:
A) Detector de Ionizao de Chama (FID)
-ons so gerados na chama e detectados.
-Detecta substncias ionizveis em chama (hidrocarbonetos)

FID:
Detector
resistente,
robusto.

5) Detectores:
B) Detector de Condutividade Trmica (TCD)
Princpio: A velocidade de perda de calor de um corpo quente depende dos gases presentes na regio.
-Apresenta resposta a todos os compostos, universal.
-Detector simples, baixo custo e boa estabilidade.

corrente eltrica

filamento
Referncia

Gs de arraste

5) Detectores:
C) Detector de Nitrognio-Fsforo (NPD)
O detector de nitrognio-fsforo utiliza um sistema similar ao FID. Entretanto ele utiliza uma pequena prola de rubdio (elemento ativo) que eletricamente aquecido. Na presena dessa fonte termoinica, compostos que contm nitrognio ou fsforo na molcula so eficientemente ionizados. Os ons so coletados e a corrente eltrica medida.
-Dispendioso e de estabilidade regular,
-Altamente seletivo
-Excelente detector para compostos contendo nitrognio ou fsforo na molcula.

5) Detectores:
C) Detector por Captura de Eltrons (ECD)
O ECD tem seu funcionamento baseado na acaptura de eltrons pela substncia a ser detectada, eltrons estes gerados pela ionizao do gs de arraste por uma fonte radioativa.
elemento radioativo Ni 63- emite partculas
+ N2
N2+ + e- (so detectados por um anodo)
X + eX- + N2+
X + N2
-Insensvel a presena de hidrocarbonetos, lcoois e cetonas.
-Sensvel para compostos clorados, bromados (halognios), compostos organometlicos.

6) Registradores (sistemas de dados)

Impressora (integrador)
-fcil de operar
-preo moderado

Computador (workstation)
-mais caro
-mais flexvel, poderoso.

ANLISE QUALITATIVA
A identificao de substncias por cromatografia em
fase gasosa se d atravs do tempo de reteno (TR)
da substncia na coluna cromatogrfica comparada
com padres.

Injeo de amostra

Injeo de padro

ANLISE QUANTITATIVA
A quantidade de analito (substncia) proporcional
rea ou a altura do pico correspondente.

1 ng de substncia

2 ng de substncia

ANLISE QUANTITATIVA

Para se calcular a concentrao de uma substncia em uma amostra necessrio se fazer uma curva de calibrao.
Duas formas:
A) Mtodo do padro externo
B) Mtodo do padro interno

ANLISE QUANTITATIVA
A) Padro externo
Faz-se uma curva com vrias concentraes do analito. A seguir injeta-se o extrato da amostra
cuja concentrao se quer determinar e lana-se no grfico as reas obtidas dos picos contra as
concentraes dos adicionados.

ANLISE QUANTITATIVA
B) Padro Interno (PI)
O padro interno (PI) um composto que se adiciona amostra, antes de qualquer manipulao (extrao) de forma que no interfira com a anlise. O PI tem a funo de corrigir possveis imprecises durante a manipulao da amostra (fase de extrao, injeo da amostra) ou
mesmo variaes no equipamento de GC.
O PI tambm tem a funo de monitorar possveis erros de operao ou procedimentos durante a anlise.
O PI deve ter preferencialmente as seguintes caractersticas:
a) nunca ser encontrado na amostra;
b) ser disponvel em elevado grau de pureza;
c) ser bem resolvido dos outros picos;
d) ser estruturalmente semelhante ao analito, ou possuir os mesmos grupos qumicos do analito.

ANLISE QUANTITATIVA
B) Padro Interno (PI)
Exemplos:

CH3
N

CH3
O CH3
C O CH CH3

O
C O CH3
O
O

Cocana
2

CH3
Etanol

Isopropilbenzoilecgonina (PI)
CH2

OH

CH3

CH2

Propanol (PI)

CH2

OH

Obs:
Para anlise qualitativa, tambm importante a presena do padro interno, pois os tempos de reteno (TR) podem variar de uma injeo para
outra, devido s variaes no prprio equipamento. Desta forma, para identificao da substncia, utiliza-se o tempo de reteno relativo (TRR)
que o tempo de reteno do analito dividido pelo tempo de reteno do padro interno. Esse valor est menos sujeito variaes.

TR PI
TR X

TRRx = TRx / TRPI

PI

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA


HPLC- HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH

Fase mvel : soluo, solventes (soluo tamponada,


metanol, acetonitrila)
Fase estacionria: coluna cromatogrfica
- Substncias que podem ser analisadas por HPLC:
antibiticos, diurticos, frmacos, drogas de abuso,
protenas, a.a., tensoativos, etc..
Ao contrrio do GC podem ser analisadas substncias
no volteis ou termicamente instveis.

ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE HPLC

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1) Vlvula de injeo de amostra


-injeo manual (loop)
-injeo automtica (amostrador automtico)
2) Bombas de presso:
100 a 500atm - permite velocidade de fluxo razovel
para o empacotamento de partculas de 3 a
10m. As vazes normalmente empregadas em
HPLC vo de 0,005 at no mximo 4 a 5ml/min.

3) Fase mvel:
A fase mvel deve ser desgaseificada para remover gases
dissolvidos que poderiam causar interferncias. Utiliza-se
ultra-som e bombas de vcuo. Tambm deve ser filtrada para
evitar entupimento da coluna cromatogrfica.
Podem ser utilizados dois tipos de eluio:
-isocrtica: quando se mantm a composio da fase mvel
constante durante toda a anlise cromatogrfica.
-programao de gradiente: quando altera-se a composio da
fase mvel durante a execuo da anlise. Utiliza-se dois ou
mais solventes com polaridades diferentes

4) Coluna cromatogrfica:

- Fase normal:
Fase estacionria polar (ex. trietilenoglicol)
Fase mvel relativamente apolar (Ex. hexano, ter isoproplico)
O componente menos polar eludo primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase mvel, o tempo de eluio diminui.
-Fase reversa
Fase estacionria no polar (Ex. hidrocarbonetos)
Fase mvel relativamente polar (gua, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar eludo primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase mvel, o tempo de eluio aumenta.
Obs. A maioria das separaes por HPLC so de fase reversa com empacotamentos
ligados de C8 ou C18 siloxanos.

5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
B) Detectores de fluorescncia
C) Detectores por ndice de refrao
D) Detectores eletroqumicos

5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
Os fotmetros UV foram os detectores mais empregados em HPLC. Eles medem as variaes na absorbncia na luz na regio de 190 a 350nm durante a passagem do efluente da coluna
na clula de fluxo. O mesmo projeto de detector, com poucas variveis permite a leitura na regio do visvel (350 a 700nm), onde, porm, a sensibilidade bem menor.
Devido a algumas razes tcnicas envolvendo as lmpadas de UV empregadas, os primeiros detectores assumiam como comprimento de onda universal de 254nm.
Atualmente existem os detectores de rede de diodos (diode array detector-DAD) que praticamente permitem levantar o espectro da substncia durante a eluio.

5) Detectores:
B) Detectores de fluorescncia
Detectam substncias que emitem fluorescncia.
C) Detectores por ndice de refrao
Os detectores por ndice de refrao medem as mudanas do ndice de refrao do efluente das colunas.
um detector universal, no seletivo, no muito sensvel e por isso empregado quando os outros no respondem ao composto de interesse.
D) Detectores eletroqumicos
Os detectores eletroqumicos se baseiam na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando estiverem na presena de um potencial eltrico.

CARACTERSTICAS DAS DUAS TCNICAS (GC E HPLC)

-Eficiente, altamente seletivo, largamente aplicvel,


-Quando utilizado PI, anlises bastante precisas,
-Boa sensibilidade,
-Necessitam de procedimentos de extrao da
amostra,
-Necessitam de equipamentos especficos e
profissionais treinados para oper-los.
-Possibilidade de se detectar vrias substncias em
uma mesma anlise,
-H possibilidade de interferentes.

Referncias
CIOLA, R. Fundamentos de cromatografia a lquido de alto
desempenho HPLC. So paulo: Ed. Edgard Blcher, 1998.
LANAS, F. Cromatografia Em Fase Gasosa. Ed. So Carlos: ACTA,
1993.
YONAMINE, M. Apresentao oral: aula expositiva. So Paulo, ago.
2004, abr. 2005.