Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

UNIRIO

Induo de dano ao DNA e apoptose por

extrato aquoso quente de Chlorella vulgaris
Hot water extract of Chlorella vulgaris induced DNA damage and apoptosis
Clinics (Faculdade de Medicina USP)
ndice h5: 29 - Mediana h5: 37

Brbara Verena Dias Galvo

Kossiwa Marcelle Esther Todjro
Rutheneia Carvalho
Hrcules Rezende Freitas

INTRODUO
Carcinoma Hepatocelular

INTRODUO
Apoptose (morte celular programada)
Agentes dietticos quimiopreventivos e caspases;
Danos no DNA e apoptose (p53 Bax, caspase-3 e -8, Noxa, PUMA e
p53AIP).

INTRODUO
Chlorella vulgaris
Alga verde unicelular do Filo Chlorophyta;
Rica em protenas*;
Propriedades antioxidantes e anticancergenas;
Estudos in vivo revelaram a eficcia
antitumoral significativa e antigenotxico de C.
vulgaris.

*Sem significncia diettica.

OBJETIVO

Determinar os efeitos antiproliferativos e apoptticos de

extratos aquosos quente de Chlorella vulgaris em linhagem
de clulas de hepatoma do tipo HepG2.

METODOLOGIA
Cultivo e extrao de Chlorella vulgaris

University of Malaya Algae Culture Collection (UMACC, Malaysia);

Bolds basal media (BBM);

Ciclo de 12 horas claro-escuro.

 Centrifugao
(1000 rpm)

Liofilizao

gua destilada
10% (m/V)

 Centrifugao
(10000 rpm por 20 min)
Condensador de refluxo
(100 C por 20 min)

METODOLOGIA
Cultura celular e tratamento
HepG2
WRL68

Eagles minimal essential mdium (MEM)

Aps 24 h
Adio do extrato aquoso de C. vulgaris em concentraes de 0-4 mg/ml.

METODOLOGIA
Ensaio de proliferao celular
2104 clulas por poo;
Tratamento com extrato aquoso
aquecido de Chlorella vulgaris;
Incubao por 24 h;
Bromodesoxiuridina (BrdU);
Soluo de desnaturao;
ELISA (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay).

METODOLOGIA

Ensaio de apoptose por mtodo fluorimtrico (TUNEL)

The DeadEnd Fluorometric TUNEL System measures nuclear DNA fragmentation ,

an important biochemical hallmark of apoptosis in many cell types.;

System measures the fragmented DNA of apoptotic cells by catalytically incorporating

fluorescein-12-dUTP(a) at 3-OH DNA ends using the Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase, Recombinant, enzyme (rTdT). rTdT forms a polymeric tail using the
principle of the TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) assay...;

The fluorescein-12-dUTP- labeled DNA can then either be visualized directly by

fluorescence microscopy or quantitated by flow cytometry....

Promega Technical Bulletin, 2009 (Promega Corporation)

Promega Technical Bulletin, 2009 (Promega Corporation)

METODOLOGIA

Determinao de danos em DNA pelo ensaio Comet

Cells embedded in agarose on a microscope slide are lysed with detergent and high salt
to form nucleoids containing supercoiled loops of DNA linked to the nuclear matrix;
loops containing a break lose their supercoiling and become free to extend toward the
anode..

Collins AR, 2004 (Molecular Biotechnology)

METODOLOGIA

p53, Bax, Bcl-2, Caspase-3 e -8 por Western blotting

The transfer step involves moving the proteins from a solution or gel and immobilizing
them on a synthetic membrane support.;
Western blotting combines the resolution of gel electrophoresis with the specificity of
immunoassays, allowing individual proteins in mixtures to be identified and analyzed.;
The primary antibody is specific for the protein of interest, and the secondary antibody
enables its detection.

BIO-RAD, Protein blotting guide (Bio-Rad Laboratories)

METODOLOGIA

Anlise estatstica (mdia desvio padro seguido de teste T de Student)

Hiptese nula versus hiptese alternativa, onde props-se que a probabilidade de
ocorrncia da hiptese nula menor que 5% (p < 0,05).

RESULTADOS

IL50

RESULTADOS

RESULTADOS

DISCUSSO
Quimiopreventivos Glicoprotena cida;
Danos no DNA plantas e algas e a atividade antioxidante;

Apoptose e terapias anticancergenas;

Como um extrato vegetal, C. vulgaris possui uma variedade de compostos,

incluindo os antioxidantes e uma glicoprotena pode agir em diferentes vias
do crescimento e sobrevivncia de clulas tumorais, provocando um efeito
antagnico de Bax e Bcl-2.

CONCLUSO

Os resultados do presente estudo sugerem que o mecanismo

anticancergeno de C. vulgaris em clulas de hepatoma (HepG2) ocorre
pela inibio da sntese de DNA, provocando danos no DNA e induo
de apoptose.

Isto mostrado pela incorporao reduzida de BrdU no DNA replicante

das clulas HepG2 e um aumento no nmero de danos por induo no
DNA e protenas apoptticas Bax e caspase-3 em clulas HepG2 tratadas
com C. vulgaris. Especula-se que o possvel mecanismo deve-se a um
aumento na expresso de p53, Bax e de caspase-3 que levaria
posteriormente apoptose.

REFERNCIAS

Constantino MG. Fundamentos de Qumica Experimental. [S.l.]: Edusp, 2003. 172 p.

Collins AR. The Comet Assay for DNA Damage and Repair: Principles, Applications, and
Limitations. Molecular Biotechnology 2004 Mar;26(3):249-61.

Bio-Rad Laboratories. Protein Blotting Guide: A Guide to Transfer and Detection. Printed
by Bio-Rad Laboratories (no publication date) Third Edition (available at: http://
www.bio-rad.com/pt-br/category/western-blotting).

Gutirrez-Ruiz MC; Bucio L; Souza V. Expression of some hepatocyte-like functional

properties of WRL68 cells in culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal,
v. 30, n. 6, p. 366-371, 1994.

Farazi PA; Depinho RA. Hepatocellular carcinoma pathogenesis: from genes to

environment. Nature Reviews Cancer, v. 6, p. 674-687, 2006.

Nascimento RDM; Santos APF; Marinho YF. Cultivo e separao de biomassa da

microalga Chlorella vulgaris. Universidade Federal Rural de Pernambuco - (sem data de
publicao).
Banner.
Disponvel
em:
http://www.claeff.com.br/index.php?option=com_phocadownload&view=category&download=7:cultivo-e-separacao-de-bioma
ssa-de-microalga-chlorella-vulgaris&id=1:downloads&Itemid=23
. Acesso em: 14 abr 2015.

REFERNCIAS

MEDLINEPLUS. Liver cancer - Hepatocellular carcinoma. Disponvel em: http://

www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000280.htm. Acesso em: 14 abr 2015.

Promega Corporation. DeadEnd Fluorometric TUNEL System: Instructions for use of

product G3250. Printed by Promega Co. Revisted in 07/09 (available at:
https://www.promega.com.br/products/cell-health-and-metabolism/apoptosis-assays/tunel-assa
ys/deadend-fluorometric-tunel-system/
).

Sigma-Aldrich Corporation. WRL 68 (HeLa derivative). Printed by Sigma-Aldrich Co.

(available
at:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/89121403?lang=pt&region=BR).