Mikhail Tswet (principios del

siglo XX), utilizo una columna

rellena de carbonato clcico
para separar varios pigmentos
vegetales
(Clorofilas
y
Xantofilas).
A.J.P.Martyn
y
R.L.M.Singe
recibieron el Premio Nobel en
1952, por sus descubrimientos
en este campo

Cromatografa
Tcnica que permite la separacin
de los componentes de una
mezcla debido a la influencia de
dos efectos que se contraponen:

Retencin

Desplazamiento

Definiciones
Se basa en el principio general de distribucin
de un compuesto entre dos fases, una fija
(FE) y otra mvil (FM).
Remocin selectiva de los componentes de
una mezcla por la accin de la F.M. que fluye
a travs de la F.E. donde se encuentran.
ELUCIN
La muestra se pone en contacto con la F.E.
Se va agregando Los solutos avanzan
arrastrados por la F.M. con mayor o menor
velocidad.
Tiempo de Retencin = Tiempo transcurrido
para la separacin de cada componente

MECANISMOS DE
SEPARACIN
ADSORCIN
La adsorcin es la propiedad que tienen ciertos slidos
de aumentar la concentracin, en su superficie, de
otras sustancias. La F.E. es un slido de gran
superficie. La La F.M. puede ser un gas o un lquido.
CGS o CLS. CGL
REPARTO O PARTICIN
La F.E. y la F.M. han de ser un lquido. La separacin se

PARTICIN O REPARTO

Clasificacin
La naturaleza de la fase estacionaria
Slido (adsorcin)
slido-lquido (LSC)
slido-gas (GSC)

Lquido (particin)
lquido-lquido (LLC)
lquido-gas (GLC)

Otras variantes
Intercambio inico (IEC)
Exclusin por tamaos (SEC)
Afinidad (AFC)

Clasificacin por el dispositivo

experimental
Plana
Columna

Aplicacin
Analtica
Preparativa

Cromatografa Plana
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa delgada. TLC
(Thin Layer Chromatography)
Cromatografa en capa delgada de
alto rendimiento HPTLC (High
performance Thin Layer
Chromatography)

Adsorbentes en CCF
Silica gel (se utiliza en el 80% de las
separaciones)
Al2O3 Almina (cida, neutra bsica)
Tierra Silcea Kieselguhr
Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
Poliamidas

Caractersticas de
adsorbentes

Tamao de Partcula
Volmen de Poro
Dimetro de Poro
rea Superficial

Homogeneidad
Pureza
Se usan como soporte del adsorbente lminas
de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Al)
Los tamaos de la placa para TLC
convencional son : 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2.
Hay placas que contienen un indicador de
Fluorescencia : F254 F366. El nmero que
aparece como subndice nos indica la longitud
de onda de excitacin del indicador utilizado.

Proceso
1.
2.
3.
4.

Eleccin de la Fase estacionaria.

Eleccin de la fase mvil.
Acondicionamiento de la placa . Requiere activacin?
Siembra de la muestra: la muestra
se aplica en la placa segn el
objetivo: Analtico Preparativa en: Banda y Punto Mancha.
5. Acondicionamiento de la cmara de desarrollo: existen varios tipos de
cmaras: Normal , doble Compartimiento , sandwich, Horizontal
6. Desarrollo de cromatograma.
7. Secado de placa
8. Revelado implica la localizacin de las zonas en que se encuentran los
compuestos ya separados, cuando stos no poseen color intrnseco.
9. Elucin se utiliza cuando se intenta remover los solutos de la fase
estacionaria.
10. Interpretacin de los resultados; Rf , Cuantificacin

Cmaras de desarrollo en TLC y

HPTLC

Desarrollo ascendente,
descendente

Revelado
Si la muestra (mancha) no es
coloreada se requiere de mtodos que
nos permitan visualizar el(los)
componente(s) presentes. Tambin se
conoce este procedimiento como
Revelado.
Estos mtodos son:
Qumicos (por inmersin o rociado).
Se
obtienen derivados coloreados
o fluorescentes
Fsicos (pticos). Generalmente se
utiliza radiacin UV

Visualizacin
fotodensitomtrica

Evaluacin de un Cromatograma de TLC

Anlisis Cualitativo
Medida de Rf
Comparacin Visual de Color/Intensidad
Propiedades UV/IR/MS/NMR
Anlisis Cuantitativo
Semi-cuantitativo
Comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la
mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin
conocida
Cuantitativo
Indirecta
Directa
Densitometra
Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs
de la sustancia.
Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la
sustancia
Espectrofotometra
Fluorescencia
Fluorescencia con "quenching"

Interpretacin de los
resultados

Interpretacin de los
resultados

FACTORES QUE AFECTAN AL

Rf
FASE ESTACIONARIA

Calidad y presencia de impurezas

presencia o ausencia de CaSO4
Naturaleza del cromatoplato, espesor,
homogeneidad y preparacin (extemporanea)
Grado de activacin en TLC de adsorcin

FASE MOVIL
Composicin y naturaleza
grado de saturacin de vapor en el tanque

TEMPERATURA
DISTANCIA DE DESARROLLO
RELACION MASA/SUPERFICIE EN LA PLACA

Serie elutrpica

Ejemplos de algunos lquidos de

desarrollo

Doble desarrollo a 90

USOS:
Separa los componentes de
una mezcla (en pequea o en
gran escala)
Criterio de pureza (nmero
de
componentes en una
mezcla)
Criterio de identificacin (por
comparacin con patrones)

Aplicaciones de la cromatografa en capa

delgada

Industria farmacutica
Control de calidad
Controles de identidad y pureza
Uniformidad
Estabilidad
Medioambiente
Anlisis de aguas, de suelos y de residuos
Anlisis de alimentos
Control de calidad
Aditivos (vitaminas)
Pesticidas
Controles de estabilidad
Medicina forense
Deteccin de documentos falsificados
Investigacin en envenenamientos
Aplicaciones clnicas
Estudios de metabolismo
Control de dopaje

Variables generales que afectan la

movilidad
ADSORBENTE
distintos tipos
distinta actividad,
inercia qumica,
el tamao del grnulo,
empaquetamiento,
homogeneidad (aumentan o disminuyen la
velocidad de recorridos).
ESTRUCTURA DEL SOLUTO
Polarizabilidad
(temporaria
o
permanente),
Capacidad
de
formar
puentes
de
hidrgeno.
Grupos ms polares: ms adsorbidos,
Alto PM: corre menos

Variables generales que afectan la

movilidad
SOLVENTE DE DESARROLLO:
Puede ser o no solvente de siembra.
De menor polaridad a mayor polaridad.
Solventes anhidros miscibles.
Velocidad de elucin : lenta: difusin de bandas.
rpida: no alcanza equilibrio
adsorcin-desorcin (implica la aparicin de un frente
deformado)
TEMPERATURA:
Para poder reproducirla.
Afecta volatilidad y solubilidades.
SATURACION DE LA CUBA:
El solvente en vez de ascender por capilaridad
continuamente, tender a evaporarse de la capa del
adsorbente para equilibrar al lquido con su P de vapor
(ascenso inhomogneo del frente de solvente).
Se agrava en mezcla de solventes.

APLICACIONES (en TLC)

Monitoreo de una reaccin
Identificacin de un compuesto
Determinacin de los componentes de una
mezcla
Comprobacin de la pureza de un
compuesto
Determinacin de un disolvente apropiado
para
llevar a cabo una separacin mediante
cromatografa preparativa
Anlisis de las fracciones recogidas en una
cromatografa en columna.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Usos: separacin y purificacin de

compuestos
orgnicos, slidos o
lquidos, a escala
preparativa.
Proceso: por gravedad o por media
presin.
Variables

Dimetro de la columna

Cantidad de adsorbente

Eleccin del solvente