Artigo : Paralisia reversvel de Schistossoma Mansoni por forclorfenuron, uma citocicina

fenilureia que afeta septinas

Ana Paula Felizatti1

Introduo
Schistossoma
mansoni

-agente causador da
esquistossomose
~500 mil de bitos mundiais
anuais (WHO, 2000)
S. mansoni uma das
principais espcies (FILHO, SILVEIRA,
2001)

-atinge mais de 50 pases

(SOUTHGATE, 1997)

-genoma complexo (1/10 do

Introduo

Introduo

Septinas
-Protenas citoesquelticas ligadoras de guanina
-Descritas inicialmente em S. Cerevisae (HARTWELL,
1971)

-Funo na formao do septo durante citocinese

-Conservadas filogeneticamente de leveduras ao
homem, exceto plantas (presente em algumas
algas verdes)
-Capacidade de formao estrutural (filamentos,
anis) refletem sua funcionalidade
-Algumas funes das septinas so:
Funes na citocinese, posicionamento do fuso
de diviso, controle do ciclo celular, trfego de
vesculas, rigidez e suporte para (DOUGLAS,
membrana
2005)
(recrutamento de protenas), morfognese celular,

(DOUGLAS, 2005
SmSEPT
5
SmSEPT
7.1
SmSEPT
7.2
(ZERAIK, 2013)
SmSEPT
4
10

Introduo
Forclorfenuron (a.k.a FCF)
Citocina
Sinttica

fator de crescimento vegetal

inibio da dinmica das septinas
no altera os demais componentes
citoesquelticos (actinas,
microtubulos)
Mecanismo no esclarecido
ferramenta para entender funes de
septinas

NCBI-PUBCHEM

Objetivos

Esclarecer a formao de complexos das septinas

e a influncia de FCF na formao dos filamentos
in vivo em S. mansoni

EFEITO
S

Patogeni
a

C
O
E
X
P
R
E
S
S

Complexo 5
SmSEPT
SmSEPT
7.2
SmSEPT1
0

Frmac
os
6

Consideraes sobre a metodologia

expresso expresso simultnea

Protenas que formam complexos
Protenas multimricas expresso de todas
as subunidades
Protenas que necessitam de auxlio para
folding correto : expresso conjunta de
chaperonas ou foldases

Sistemas descritos
para leveduras,
mamferos,
Insetos, bactrias
7

Um vetor
Mltiplos vetores

Consideraes sobre a metodologia

xpresso expresso simultnea

Pontos crticos

Compatibilidade de
plasmdeos
-Origem de replicao
diferentes
-Resistncia diferente

Concentrao de antibiticos
usar metade quando for mais de
um vetor
8

(Tolia and Joshua-Tor, 2006)

Consideraes sobre a metodologia

xpresso expresso simultnea

pET28a e pET21a
Expresso de duas subunidades de protena humana
relacionadas a apoptose
Mesmo replicon
Diferentes resistncias Expresso correta subunidades expressas e com

atividade caspase, somente possvel caso ocorresse a

9
coexpresso

Materiais e Mtodos

o de complexos de Septinas Co-Expresso

SmSept 5 e 7.2
His-Tag N-terminal

Retirado de: <http://www.helmholtz-

10

Materiais e Mtodos

o de complexos de Septinas Co-expresso

SmSept10

ado de: <http://biochem.web.utah.edu/hill/links/pACYCDuet-1.pdf>

11

Materiais e Mtodos

o de complexos de Septinas Co-expresso e Co-purificao

Preparar os insertos (PCR) e ligar nos vetores em
reaes diferentes
Ao transformar mais de um plasmdeo em E. coli,
esperar as clulas se recuperarem (1hr) antes de
(Tolia and Joshua-Tor, 2006)
plaquear

0.4 mM IPTG, 16 h, 18C, LB

Centrifugao
Sonicao*

*Tampo de ressuspenso:
50 mM de Tris-HCl pH 8
500 mM de NaCl
12% Glicerol
10 mM de Beta-mercaptoetanol

Resina de Cobalto
(Tolia and Joshua-Tor, 2006)

Complexo eludo
em
500 mM de
SmSept 10, 5 e
imidazol
7.2

Sm
Se
10, pt
5
e7
.2

SDS PAGE

2 purificao
Superdex-200
(Akta Purifier)
(Excluso Molecular)
12

o-expresso

Sumarizando : Co-expresso
*
BL21(DE3)

Transformao

Transformao

Plaquear e selecionar
recombinantes
Crescimento da cultura
Induo da expresso
(IPTG)
Pelletar, lisar, remover
restos celulares
Filtrar o sobrenadante
Copurificao em coluna
de afinidade e excluso
molecular

* : Inserto previamente obtido

PCR
Plasmdeo de propagao
DH5a
Anlise de Restrio
*
13

Sumarizando : Co-purificao

o-purificao
Sobrenadante:
Extrato
contendo
protenas
solveis

Funil com filtro

Resina de Cobalto
Afinidade por His-Tag

Aumento da [imidazol] :
eluio dos complexos em
ordem crescente de
afinidade

Eluio final:
Complexo de septinas
demais formas so
eludas antes
apenas as formas
com complexo resistem
na coluna em
consequncia da His-Tag

2 etapa -> excluso

molecular : selecionar
e conhecer os
complexos formados
14

Materiais e Mtodos

Sm
S
10, ept
5e
7.2

Espectrometria de Massas : conhecer/confirmar os peptdeos do

heterocomplexo obtido
recorte do gel, descorar, desidratar, tripsinizar, extrao dos peptdeos
Injeo em equipamento anlise (MASCOT) busca em banco de dados
(especfico
S. mansoni)
Microscopia
de Transmisso eletrnica: visualizao da
polimerizao das septinas
complexo de septinas (2.2 mg/mL) em tampo, dializado com outro
tampo contendo FCF ou DMSO (controle) por 30 min a 4C
alquotas aplicadas em suporte fixadas com acetato de uranil e
analisadas
em TEMo tamanho molecular do complexo
DLS: determinar
complexo de septinas a 0.2 mg/mL em tampo foi dializado com outro
tampo
contendo FCF por 30 min a 4C
alquotas aplicadas em cubas de quartzo e inseridas em detector da luz
polarizada
temperaturas : 22C e 90C
Software acoplado: controle e grficos
15

Resultados

Purificao
2 etapas

1: Afinidade
Resina de Cobalto
2 Excluso Molecular
Gel filtrao

Resultado da gel filtrao

mostrou diversas populaes de
complexos formados, todos
incluindo as trs formas
recombinantes

SmSEPT7.2 59.2
kDA
SmSEPT5
51.3kDA
SmSEPT10 48.1
kDA

16

Resultados
Espectrometria de Massas
Fraes moleculares com massa
molculas de ~300-400 kDA foram
selecionados para MS
Confirmao de complexos
heterogneos
Peptdeos correspondentes as 3
protenas foram detectados
Anlise por(combinaes)
TEM
Estruturas parecidas com septinas de
leveduras e humanos quando em
contato com altas concentraes de sal
: desmanche dos filamentos e
formao de oligmeros

17

Resultados

Efeito FCF -TEM

Complexo em tampo para
incio da polimerizao
Lag fase mesmo na presena
de FCF 3A, 3F
Poucos filamentos vs.
numerosos ps 20 min : 3B e

3G

Ps 3 horas: formas maduras

detectadas em ambas
condies: 3C, 3E, 3H, 3I

-formaes diferentes

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Resultados

feito FCF - DLS

minar possveis diferenas entre os tamanhos dos filamentos formados sob efeito do FCF

Soluo com FCF resultou

em partculas (filamentos)
maiores
-Reduo da fora inica
acelera a formao de partculas e
FCF acelera ainda mais esse
processo

19

Materiais e Mtodos

no de 4 estgios de vida do S. mansoni

NRMI (Porto Riquenho) S. mansoni

Vermes adultos por

perfuso portal do
camundongo
Bimphalaria glabrata

Swiss-Webster Mice

Ovos no fgado do
camundongo
Miracdios eclodindo os
ovos
Cercria iluminando e
20
aquecendo os caracis

Materiais e Mtodos
Sm
S
10, ept
5e
7.2

FCF - concentraes
0 -500 uM : Cercrias e vermes adultos (meio de
cultivo)
0- 200 uM : Miracdeos (gua)
Reversibilidade: retorno a meio livre de FCF
Visualizao das variaes fenotpicas : Microscpio
invertido + cmera
filmagens : 10 frames/segundo
Efeito na mobilidade de schistossomos e na ecloso
dos ovos: xCELLigence system, monitoramento em tempo
real de eventos celulares
antes, durante e depois da aplicao de FCF

21

Resultados

Paralisia Reversvel
FCF no meio de cultivo

Efeito em adultos

22

Resultados

Paralisia Reversvel
FCF no meio de cultivo

Efeito em cercrias

23

Resultados

Paralisia Reversvel
FCF no meio de cultivo

Efeito nos miracdios

24

Resultados

25

Resultados

eito de FCF na mobilidade

xCELLigence RTCA
E-plates

Adultos

26

Resultados

eito de FCF na mobilidade

xCELLigene RTCA
E-plates
Medida indireta

27

Discusso
-S. mansoni apresenta septinas de 3 subgrupos de septinas, que formam estruturas de alta
ordem, semelhantes a de outras espcies forma de organizao conservada
-FCF estabiliza as septinas de S. mansoni, e estas septinas estabilizadas por FCF no so
funcionais, efeito idntico a experimentos com RNAi
-FCF altera a mobilidade de diferentes formas do verme, de maneira reversvel, e pode
levar a morte.
-Paralisia provavelmente relacionada a localizao das septinas, prevalentemente em
msculos de S. mansoni
-Derivados de FCF podem ser utilizados como frmacos anti-esquistossomase : baixa
toxicidade (comprovada)
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Referncias
BERRIMAN, M. et al. The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature. v. 460, n. 7253, p. 352-U65, Julho
2009.
DOUGLAS, Lois M. et al. Septin Function in Yeast Model Systems and Pathogenic Fungi. Eukaryotic Cell 4.9 (2005):
15031512. PMC. Setembro de 2005.
FILHO, R.P.; SILVEIRA, M.A. Panorama atual da esquistossomase no mundo. Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences, Brasil, v. 37, n. 2, p. 123-135 , Maio/agosto 2001.
HARTWELL, L., 1971. Genetic control of the cell division cycle in yeast. IV. Genes controlling bud emergence and
cytokinesis. Exp. Cell Res. 69, 265276.
SOUTHGATE, V. R. Schistosomiasis in the Senegal river basin: before and after the construction of the damas at
Diama, Senegal and Mantali, Mali and future prospects. Journal of Helmintology, London, v.71, n 02, p.125-132, Junho
1997.
TOLIA, N.H.; JOSHUA-TOR, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nature Methods. V 3, n. 1, Janeiro
de 2006.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Schistosomiasis. 2000. Disponvel em: <http://www.who.int/ctd/schisto/ index.html.>
Acesso em maro de 2015
29

Obrigada
30