TCNICAS

INMUNOHISTOQUMICAS

BASES CONCEPTUALES
INMUNOHISTOQU
INMUNOHISTOQU
MICA
MICA

Tcnica que permite detectar IN SITU

componentes
celulares, a travs de anticuerpos
especficos + sistema de deteccin
enzimtico

Ventajas:
Conserva las relaciones entre los componentes de estudio
Permite la identificacin celular
En el mbito Inmunocitoqumico, permiten precisar el diagnstico
en un 76% de los casos
Su desarrollo fue denominado como: revolucin marrn, por
el uso de diaminobencidina como cromgeno o como
revolucin natural al imitar la reaccin Ag-Ac.

3 FACTORES
RESPONSABLES DEL
AVANCE IHQ :
1. Disponibilidad de gran n de

Ac que funcionan en parafina.

2. Desarrollo de tcnicas de

recuperacin Ag, as se
obtienen resultados fiables
en tejido fijados e increment
la sensibilidad.
3. Aparecen sistemas de

deteccin muy sensibles.

Sensibilidad: hace referencia a
la cantidad mnima de Ag que
una tcnica es capaz de
detectar. Una alta sensibilidad
es capaz de detectar pequeas
cantidades de Ag.

ANTGENO
Se denomina as a la sustancia que se quiere detectar en
una seccin tisular o frotis. Acta como sustancia extraa
cuando es inyectado a un animal de experimento
Tipos:
Tipos:
1.
1. Continuos:
Continuos: compuesto
compuesto por
por
una
una secuencia
secuencia lineal
lineal de
de 3-8
3-8
aminocidos
aminocidos contiguos
contiguos
2.
2. Discontinuos:
Discontinuos:
(conformacionales)
(conformacionales)
secuencias
secuencias aminoacdicas
aminoacdicas
distante,
distante, puestas
puestas en
en contacto
contacto
por
por el
el plegamiento
plegamiento
conformacional
conformacional
HAPTENOS: molculas de pequeo tamao (<10kDa), incapaces
de inducir una respuesta inmune. Para adquirir carcter
inmunognico deben acoplarse a una protena transportadora grande
(ej: tiroglobulina, hemocianina o albmina srica bovina)

EPTOPE O
DETERMINANTE
ANTIGNICO: (proteicos)
induce la respuesta
inmune, por lo que es
reconocida por el anticuerpo.
Segn el peso molecular
cada uno presenta un n
determinado de eptope.

ANTGENO

ANTGENO
Generalmente protenas que son los inmungenos ms
potentes, pero tambin pueden ser lpidos, polisacridos e
incluso cidos nucleicos.
Es reconocido por un paratopo
ESQUEMA
ESQUEMA DE
DE EPTOPE
EPTOPE
CONTINUO
CONTINUO

ESQUEMA
ESQUEMA DE
DE EPTOPE
EPTOPE
DISCONTINUO
DISCONTINUO

ANTICUERPO
Tambin denominados Inmunoglobulinas, son glicoprotenas
sintetizadas por las clulas plasmticas

COMPOSICIN
COMPOSICIN
2 pares de cadenas
polipeptdicas
idnticas

Par
Par de
de
cadenas
cadenas
LIGERAS
LIGERAS

Kappa y lambda
(220 aminocidos)

Par
Par de
de
cadenas
cadenas
PESADAS
PESADAS
(alfa,
gamma, delta,
psilon, mu) (440
aminacidos)

Unin por
puentes disulfuro

Determinan la
clase: IgA, G, M, D,
E

Molcula
Molcula de
de Ig
Ig formada
formada
por
por cadenas
cadenas pesadas
pesadas yy
livianas
livianas unidas
unidas por
por
puentes
puentes de
de disulfuro
disulfuro

Molcula
Molcula de
de Ig
Ig con
con extremo
extremo
carboxilo
carboxilo (regin
(regin
constante)
constante) yy amino
amino
terminal
terminal (regin
(regin variable)
variable)

ANTICUERPO
La digestin de Igs con la
enzima proteoltica
papana genera: 2
fragmentos especficos de
unin al antgeno:
1. Fab (antigen binding)
2. Fc (fragmento
cristalizable): comn
en todos los
individuos de la
misma especie.
La digestin
mediante
pepsina, origina aparte del
fragmento Fc un
fragmento bivalente de
unin al Ag : F(ab), el cual
se emplea en vez del
anticuerpo completo cuando
se quiere evitar Fc en la
cadena de deteccin

ANTICUERPO
Los Ac empleados en IHQ son generalmente IgG (150kDa) y
pocas veces IgM (900kDa).
IgA: forma dmeros
IgM: forma pentmeros grandes (se unen 5 molculas de Ig)

Las Igs pueden actuar

como Ag mediante el
fragmento Fc, de esta
forma permiten la
unin de un
anticuerpo
secundario

ANTICUERPO
PARATOPO
PARATOPO
EPTOPE
EPTOPE

UNIN
UNIN ENLACE
ENLACE NO
NO
COVALENTE
COVALENTE
Comunes,
Comunes, cargas
cargas
Inica
Inica
electrostticas
electrostticas positivas
positivas en
en el
el
ss
Ac
Ac yy negativas
negativas en
en el
el Ag
Ag
Puentes
Puentes de
de
hidrgeno
hidrgeno
Interacciones
Interacciones
hidrofbicas
hidrofbicas
Fuerzas
Fuerzas de
de van
van der
der
Waals
Waals

ANTICUERP
O

La unin no covalente es

reversible, por lo que

puede disociarse
durante los lavados.
Se genera una reaccin

de equilibrio:
Ag + Ac

AgAc

Afinidad: grado de
complementariedad entre
paratopo y eptope y su
fuerza de unin.
Avidez: fuerza conjunta
con la que un antisuero
(formado por Ac) se une a
un Ag multivalente
complejo

TIPOS DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES:

Tcnica de hibridoma
(Khler y Milstein). Obj:
obtener Ac de
especificidad definida
ilimitado.

POLICLONALES:

Se obtienen por
extraccin
del suero de
Obtencin
Obtencin
un animal previamente
inmunizado con el Ag a
estudiar.

POLICLONALES:
POLICLONALES:
Luego
Luego de
de aislar
aislar la
la clula
clula
hibridada,
hibridada, se
se dejar
dejar en
en
cultivo
cultivo celular
celular para
para
comprobar
comprobar especificidad
especificidad yy
afinidad
afinidad del
del Ac.
Ac.
Cultivo:
Cultivo: in
in vitro
vitro (a
(a partir
partir
del
del sobrenadante)
sobrenadante) oo in
in
vivo
vivo (extraer
(extraer del
del mismo
mismo
animal).
animal).
Ventajas:
Ventajas: Especificidad,
Especificidad,
reproducibilidad,
reproducibilidad,
disponibilidad,
disponibilidad,
reconocimiento
reconocimiento de
de epitope
epitope
lineal.
lineal.
Desventajas:
Desventajas: menor
menor
sensibilidad,
sensibilidad, probabilidad
probabilidad
de
de falsos
falsos negativos,
negativos, menor
menor
estabilidad
estabilidad al
al pH
pH yy
concentraciones
concentraciones salinas
salinas yy
imposibilidad
imposibilidad de
de eliminar
eliminar

Ventajas:
Ventajas: la
la mezcla
mezcla de
de
varias
varias Igs
Igs har
har que
que el
el Ac
Ac
policlonal
policlonal presente
presente gran
gran
avidez
avidez por
por el
el Ag.
Ag. Alta
Alta
sensibilidad
sensibilidad poco
poco
probable
probable que
que ocurra
ocurra un
un
falso
falso negativo)
negativo)
Desventajas:
Desventajas: presentan
presentan
un
un amplio
amplio rango
rango de
de
especificidad,
especificidad, pueden
pueden
dar
dar origen
origen aa reacciones
reacciones
cruzadas.
cruzadas. Problemas
Problemas de
de
reproducibilidad.
reproducibilidad.
Disponibilidad
Disponibilidad limitada.
limitada.

Patrn de tincin
altamente selectivo (foto
con pequeo y gran
aumento)

Los
Los prospectos
prospectos
(data
(data sheets)
sheets) que
que
vienen
vienen con
con los
los Ac
Ac
comerciales
comerciales
debera
debera incluir
incluir la
la
siguiente
siguiente
informacin:
informacin:

Patrn de una banda

proteica el tamao
esperado en Western
Blot
Desaparicin de
tincin tras
preabsorcin del
antisuero con el
eptope puro
Ausencia de tincin de
tejidos en ratones con
dficit e la protena
Patrn de tincin
idnticos para Ac
contra diferentes
eptope de la misma
protena

DILUCIN

Ac comerciales: presentacin como liofilizado (forma lquida

100ul o 1ml), deben reconstituirse con H2O destilada .
Generalmente estn diluidos en tampn con pH prximo al fisiolgico
(no se recomienda PBS, puesto que incrementa tincin inespecfica).

Tampn: cida sdica (NaN3): evita el crecimiento bacteriano/

detergente (Tween): facilita la penetracin del Ac/ albmina srica
bovina (1%): evita reactividad inespecfica e inhibe Ac anti-albumina

Ttulo: (concentracin absoluta de Ac monoclonal) se mide en ug o

mg por mL, para Ac policlonal se utiliza ug de Ag precipitado por mL
de antisuero.

Dilucin ptima: la que proporciona mxima relacin seal/fondo.

Mxima tincin especfica y mnima inespecfica. Es en funcin de la
concentracin inicial y la afinidad del Ac

La dilucin ptima de un Anticuerpo policlonal es superior al

monoclonal

EFECTO
EFECTO PROZONA
PROZONA

Concentracin
Concentracin excesiva
excesiva de
de
Anticuerpos
Anticuerpos la
la seal
seal
disminuye
disminuye oo incluso
incluso puede
puede ser
ser
inhibida
inhibida

La cantidad de ANTICUERPOS a tomar para una

determinada dilucin final de trabajo se obtiene:
Vol.
Vol. Ac:
Ac: 1/
1/ dilucin
dilucin inicial
inicial xx
vol.
vol. Final
Final
________________________
________________________
1/dilucin
1/dilucin
final
final
Existe la venta de Ac pre diluidos optimizados para
condiciones estndar. Desventajas: almacenamiento
de 4C y tiempo de caducidad corto

INCUBACIN

Influye en la reaccin Ag-Ac

(temperatura y tiempo)

Cmara hmeda: se usa

para incubaciones largas.

Un aumento de T:
incremento de fondo e
inactivacin de Ac

Como tampn de lavado se

usa: TBS (Tris-HCl, NaCl,
pH 7.6)

1. Tiempo: se puede dejar

incubando toda la noche (16hrs.)

y as aumentar la dilucin y
economizar Ac. Habitualmente se
incuba por 1 hora.
2. Temperatura: a 37C permite

acelerar la reaccin y aumentar

la seal usando cmara hmeda.
Se suele incubar a T ambiente
Luego de cada etapa se debe

lavar para remover molculas que

se han unido inespecficamente

ALMACENAMIENT
O

Anticuerpos liofilizados: no
hay problema de
conservacin.
Almacenamiento: 4C
(meses) o congelados
-20C/-80C (aos).

Evitar proceso de
congelacindescongelacin, puesto que
pueden alterar la
estructura del Ac. Proceso:
1. Diluir en alcuota el Ac
2. Mezclar el Ac con glicerol
(disminuye punto de
congelacin)
Para comprar Ac
considerar: resultados, ms
frecuente empleado, que

A
Annttiiccuueerp
ml: 1
aallccuuot rpoo 11m
otaass ddee 1 l: 100
10000uull

INFORMACIN VALIOSA DE LOS AC

Eptope
Eptope usado
usado en
en la
la inmunizacin
inmunizacin
Tipo
Tipo de
de Ac,
Ac, especie
especie que
que se
se obtuvo
obtuvo
Reactividad
Reactividad interespecie
interespecie
Purificacin,
Purificacin, formato,
formato, caducidad
caducidad
Concentracin
Concentracin yy dilucin
dilucin
Aplicaciones
Aplicaciones
Recuperacin
Recuperacin Ag
Ag

PRESERVACIN Y
PROCESAMIENTO DE
LA MUESTRA

TIPO DE
MUESTRAS
MUESTRAS CITOLGICAS
CULTIVO CELULAR
Monocapa cultivado sobre porta o
cubreobjeto

FROTIS
CYTOSPINS
Anlisis de lquidos de cavidades serosas

CITOLOGA EN MONOCAPA EN MEDIO

LQUIDO
BLOQUES CELULARES

TIPO DE
MUESTRAS
MUESTRAS
HISTOLGICAS
CONGELACIN
Usualmente para msculo y tejido nervioso

INCLUSIN EN PARAFINA
CORTE POR VIBRATOMO

FIJACIN

Objetivo: detener metabolismo celular, inactivar enzimas

lisosmicas y eliminar microorganismos. Proceso irreversible.

Parmetros a considerar:
pH
pH
Temperatura
Temperatura
Velocidad
Velocidad de
de penetracin
penetracin
Duracin
Duracin
Tiempo
Tiempo transcurrido
transcurrido desde
desde la
la extraccin
extraccin de
de la
la
muestra
muestra
Tamao
Tamao de
de la
la muestra
muestra

TIPOS DE FIJADORES
RETICULANTE
RETICULANTE O
O
ADITIVOS
ADITIVOS
Formaldehdo
Paraformaldeh
do

PRECIPITANTES
PRECIPITANTES
O
O
CUAGULANTES
CUAGULANTES
Etanol
Metanol

MEZCLAS
MEZCLAS
FIJADORAS
FIJADORAS
B5
Zenker
Bouin
Paraformaldeh
doGlutaraldehdo
Carnoy
Metacarn
(metanolcarnoy)

PROTOCOLO DE
FIJACIN
1. MUESTRAS

CITOLGICAS: etanol
96 por 20 min. a
temperatura ambiente.
Se pueden dejar las
muestras en alcohol.
2. MUESTRAS

HISTOLGICAS:
formalina al 10% por
24horas (penetra el
tejido 1mm/h). Se debe
evitar la sobrefijacin
(ms de 48hrs.) se
reduce la antigenicidad

CONGELACIN
CONGELACIN
Fijacin
Fijacin fsica.
fsica. Aumenta
Aumenta la
la sensibilidad,
sensibilidad, pero
pero disminuye
disminuye la
la morfologa
morfologa
PRINCIPIO:
PRINCIPIO: El
El fro
fro provoca
provoca la
la detencin
detencin de
de procesos
procesos biolgicos
biolgicos

AGENTES
AGENTES CRIOGNICOS
CRIOGNICOS
Nitrgeno
Nitrgeno lquido
lquido (-196C):
(-196C): no
no usar
usar guantes,
guantes, ni
ni recipientes
recipientes hermticos.
hermticos.
Isopentano
Isopentano (2-metilbutano)
(2-metilbutano) enfriado
enfriado en
en nitrgeno
nitrgeno lquido
lquido aa -160C
-160C oo bao
bao
isotrmico
-50C.
Es
inflamable
isotrmico -50C. Es inflamable

PROTOCOLO
PROTOCOLO DE
DE CONGELACIN
CONGELACIN
Congelacin
Congelacin en
en isopentano
isopentano por
por 1min
1min (evitar
(evitar contacto
contacto
directo
directo de
de las
las muestras)
muestras)

ALMACENAMIENTO
ALMACENAMIENTO DE
DE MUESTRAS
MUESTRAS
-196C
-196C (nitrgeno
(nitrgeno lquido).
lquido).
-20
-20 oo -80C
-80C (congelador)
(congelador)

SECCIN
SECCIN
Cortes
Cortes aa 55 micras
micras yy portaobjetos
portaobjetos con
con polilisina
polilisina (carga).
(carga).
Los
Los cortes
cortes se
se guardan
guardan aa -20
-20 oo -80C
-80C

PROCESAMIEN
PROCESAMIEN
TO
TO EN
EN
PARAFINA
PARAFINA
ALMACENAMIENTO
ALMACENAMIENTO
Si
Sian
anno
nose
sehar
harla
la
tcnica,
evitar
tcnica, evitarpaso
paso
anterior
anterior(produce
(produceprdida
prdida
de
antigenicidad)
de antigenicidad)

DESHIDRATACIN
DESHIDRATACIN
Alcoholes
Alcoholescrecientes
crecientes

DESPARAFINADO
DESPARAFINADO
HIDRATACIN
HIDRATACIN

ACLARAMIENTO
ACLARAMIENTO
Disolvente
Disolventedel
delmedio
mediode
de
inclusin
que
se
inclusin que semezcle
mezcle
con
conel
elalcohol
alcohol

Pasos
Pasospor
porxilol
xilol
Alcoholes
Alcoholesdecrecientes
decrecientes

SECCIN
SECCIN
Cortes
Cortesde
de44micras,
micras,evitar
evitar
cualquier
pliegue.
cualquier pliegue.
Se
Sesecan
secanaa60C
60C1hora
1horaoo
45C
toda
la
noche
45C toda la noche

INCLUSIN
INCLUSIN
Parar
Pararde
dematerial
material
semilquido
semilquidoaaslido
slido(punto
(punto
de
fusin
60C)
de fusin 60C)

CMO EVITAR LA PRDIDA DE

ANTIGENICIDAD?
Almacenar los cortes a -20C
A temperatura ambiente con la capa de parafina

VENTAJAS:
SECCIN POR VIBRTOMO

Cortes obtenidos por

vibracin transversal de la
cuchilla. (utilizado ms en:
cerebro).
Necesita buena fijacin y

muestras no muy gruesas

El portamuestras con la

pieza adherida se sumerge

en tampn fosfato, las
secciones individuales se
recogen con pincel y se
procesa por flotacin.

1.

No requiere
deshidratacin/inclusin

2.

No emplea altas t, ni
qumicos agresivos

3.

Menor artefacos

4.

Menor autoflorecencia

Desventajas:

1.

Secciones delicadas y difcil

de manejar

2.

Secciones ms gruesas,
menor adhesin a
portaobjetos

3.

Incubaciones ms largas

FIN
A ESTUDIAR