Universidad Nacional de

Trujillo

METODOS CROMATOGRAFICOS
Y ELECTROFORESIS CAPILAR
Los alumnos:
Apaza Escobedo, Werner.
vila Alayo, Ugo.
Esquivel Guevara, lvaro.
Guerrero Trujillo, Juan Diego.
Vela Ramirez, Oscar.

Mtodos cromatogrficos y
Electroforesis capilar

TEMAS:
-Cromatografa de intercambio inico.
-Cromatografa inica.
-Cromatografa de exclusin
molecular.
-Cromatografa de afinidad.
-Fundamento de la electrolisis capilar.
-Modo de hacer una electroforesis
capilar.

Electroforesis

En la electroforesis y en la electrocromatografia, un
campo elctrico fuerza al liquido a pasar a travs de un
tubo capilar por electrosmosis. Este proceso permite
crear chips analticos de miniaturas, en los cuales los
fluidos circulan a travs de canales capilares grabados
en vidrio o en la plstico. Las reacciones qumicas y la
separaciones qumicas se llevan acabo sobre este chips
En un futuro , los analistas podrn llevar un laboratorio
en un chip para realizar investigaciones de campo que
hoy en da requiere laboratorios completos.

Cromatografa
de
intercambio
inico:
Est basada en la atraccin entre los iones del
soluto y los centros cargados unidos a la fase
estacionaria . En los intercambiadores aninicos
,los grupos cargados positivamente en fase
estacionaria atraen a los aniones del soluto. Los
intercambiadores catinicos contienen puntos
cargados negativamente, unidos por enlace
covalente ala fase estacionaria , que atraen a los
cationes
del
soluto.

Intercambiadores

ionicos:

Las resinas son partculas amorfas (no cristalina)

de material orgnico. Las resinas de poliestireno,
usadas en intercambiadores inicos , se obtiene
copolimerizacin de estrenos y divinilbenceno.

- Selectividad del intercambio

inico:
Los intercambios inicos fijan preferentemente
los iones de mayor carga , menor radio hidratado
y mayor polarizabilidad.

- Un orden bastante general de selectividad

frente a cationes es el siguiente:

-Equilibrio Donnan:
cuando un intercambio inico se introduce dentro de una
disolucin de electrolito ,la concentracin del electrolito
es mayor fuera que dentro de la resina .El equilibrio
entre los iones de disolucin y los iones dentro de la
resina
se
llama
equilibrio
Donnan.
-Modo de hacer una cromatografa de intercambio
inico:
las resinas de intercambio inico se usan en aplicaciones
en las que intervienen molculas pequeas, que pueden
penetrar en los poros pequeos de la resina.

-Aplicaciones de intercambio inico:

. Se puede usar para convertir una sal en otra.
.Se usa para preconcentrar componentes traza de una disolucin ,alcanzar as un nivel de concentracin adecuado
para hacer un anlisis.
.Para purificar agua.

Cromatografia ionica
Se usa en la industria de semiconductores para controlar concentraciones de 0.1ug/L de aniones y cationes en
agua desionizada.
Es una VERSION DE ALTA EFICACIA DE LA CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO, se ha convertido en el mejor
mtodo de anlisis de aniones.

-Cromatografa aninica y
catinica con supresin inica:
La
cromatografa
de
aniones
con
supresin inica, consiste en la separacin de
una mezcla de aniones por intercambio inico y
su deteccin por conductividad electricidad. La
caracterstica fundamental de una cromatografa
con supresin de iones es la eliminacin del
electrolito que no interesa antes de medir la
conductividad.

La cromatografa catinica con supresin

inica, se lleva a cabo de una manera anloga
pero el supresor sustituye el Cl- que sale de la
-

La columna de separacin
separa los analitos, y la
columna de supresin
sustituye
el eluyente inico por
especies
no inicas.

CROMATOGRAFIA CATIONICA CON SUPRESION IONICA.

Se lleva a cabo de una manera anloga a la aninica, pero el
supresor
sustituye el Cl- que sale de la columna con OH- a travs de una
membrana de intercambio inico.

CROMATOGRAFIA IONICA SIN SUPRESION.

Si la capacidad de intercambio inico de la columna de
separacin es
suficientemente baja y se usa un eluyente diluido, la supresin
de i
iones es innecesaria.
. Cromatografa aninica sin supresin. Se usa una resina de
capacidad de intercambio de alrededor 5x10-9 equiv./g y un
eluyente
de sales Na+ y K+ de Ac. Benzoico, p-hidroxibenzoico o c.
Ftalico 10-4
M. Estos eluyentes dan una conductividad de fondo baja, y los
analitos
se detectan por una variacin pequea de conductividad
cuando salen
de la columna.

. Cromatografa catinica sin supresin.

Se realiza utilizando como eluyente ac. Ntrico diluido para
iones
monovalentes y sales de etilendiamonio
para iones
divalentes.
DETECTORES. Los detectores de conductividad responden a
todos
los iones. En cromatografa con supresiones de iones es fcil
medir un
analito, porque la conductividad del eluyente se reduce
prcticamente
a cero gracias al paso de la supresin. La supresin tambin
nos
permite usar gradientes de concentracin en el eluyente.

CROMATOGRAFIA DE PARES IONICOS.

Utiliza una columna de HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA
RESOLUCION) de fase inversa, en lugar de una columna de
intercambio inico. Para separar una mezcla de cationes se
aade a la
fase mvil un tensioactivo aninico come el Octano sulfonato
sodico

Cromatografa de exclusin molecular

En la cromatografa de exclusin molecular
(tambin llamada filtracin por gel o cromatografa de permeacin por
gel ), las molculas se separan segn su tamao .Las molculas
pequeas penetran en los poros pequeos de la fase estacionaria ,pero
no la molculas grandes. Puesto que las molculas pequeas tienen que
recorrer un volumen realmante mayor, las molculas grandes se eluyen
primero. Esta tcnica se usa mucho en bioqumica para purificar
macromolculas.

a)

b)

Las molculas grandes no pueden

penetrar en los poros de la fase
estacionaria. Se eluyen con un volumen
de disolvente igual al volumen de la fase
mvil.
Las molculas pequeas, que se pueden
encontrar dentro y fuera del gel,
necesitan un volumen mayor para
eluirlas. Vt es el volumen total de la
columna ocupada por el gel ms el
disolvente. V0 (=Vm) es el volumen de
la fase mvil. Vt V0 es el volumen
ocupado por el gel ms su fase lquida
interna.

-Ecuacin de elucin:
En cromatografa de exclusin molecular, el volumen de la fase mvil (V m) se llama ,
normalmente, volumen vacio, V0 .La cantidad Km se define como
Km = Vr-V0
V t V0
donde Vr es el volumen de retencin de un soluto, y V t el volumen total de la columna (V t= r2 x
la longitud , donde r= radio).En el caso de molculas grandes que no penetran en el gel, V r= V0
y
Km=0. En el caso de una molcula pequea que penetran en algunos poros del gel, pero
no en otros ,de forma que K m vale entre 0 y 1.Idealmente,la penetracin en gel es el nico
mecanismo por el cual son retenidas las molculas en este tipo de cromatografa . En realidad ,
siempre existe algo de adsorcin de modo que K m puede ser >1.

-Fase estacionarias:
Entre los geles utilizados en columnas abiertas de exclusin
molecular, a escala preparativa, se encuentran el Sephadex y
el Bio-GelP.
Cuanto menor es el tamao de partcula de gel, mayor es la
resolucin , y mas lento el flujo a travs de la columna.

-Determinacin de masa moleculares:

La filtracin por gel se usa principalmente para se para
molculas de masa moleculares significativamente distinta.


NOMBRE

Intervalo de Fraccionamiento
(masa molecular) para protenas
globulares

NOMBRE

Sephadex G-10
Sephadex G-15
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-75
Sephadex G-100
Sephadex G-150
Sephadex G-200

a 700
a 150
1000-5000
1500-30000
3000-80000
4000-150000
5000-300000
5000-600000

Bio-Gel P-2
Bio-Gel P-4
Bio-Gel P-6
Bio-Gel P-10
Bio-Gel P-30
Bio-Gel P-60
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-150

Bio-Gel P-200

Bio-Gel P-300

Sephacryl S-200
Sephacryl S-300

5000-250000
10000-15000000

Bio-Gel A-0.5 m

Bio-Gel A-1.5 m

Bio-Gel A-5 m

Sepharose 2B
Sepharose 4B

Intervalo de Fraccionamiento
(masa molecular) para protenas
globulares

70000-40000000
60000-20000000

Bio-Gel A-15 m
Bio-Gel A-50 m

100-1800
800-4000
1000-6000
1500-20000
2500-40000
3000-60000
5000-100000
15000-150000
30000-200000
60000-400000

<10000-500000
<10000-1500000
10000-5000000
40000-15000000
100000-50000000

Silice TSK SW para cromatografa de exclusin molecular HPLC

Designacin

Tamao de poro
(nm)

Intervalo de masa molecular para

protenas globulares

G2000SW

13

500-60000

G3000SW

24

1000-300000

G4000SW

45

5000-1000000

G5000SW

100

>1500000

Curva de calibrado de

masas moleculares del

poliestireno en una
columna de exclusin
molecular Beckman
uSpherogelTM (de 7.7
cm de dimetro por 30
cm de longitud). Los
diferentes geles usados
tenan tamaos de poro
entre 5 nm y 100 um.
[Con autorizacin de
anspec Co., Ann Arbor,
MI]

Cromatografa de afinidad
Se usa para aislar un nico compuesto de una mezcla compleja. La
tcnica se basa en el enlace especifico de ese compuesto con la fase
estacionaria.
La cromatografa de afinidad es especialmente aplicable en
bioqumica, se basa en interacciones especificas entre enzimas y
sustratos, anticuerpos antgenos o entre receptores y hormonas.

Fundamento de la electroforesis
capilar
Los capilares para electroforesis pueden ser tan pequeos que pueden se
insertados en una clula viva de suficiente tamao, para analizar su
contenido.
Alternativamente, se pueden tomar con un capilar clulas mas pequeas ,
una, a una ,reventarlas y analizarlas.
La electroforesis capilar permite resoluciones sin precedentes.

electroforesis
capilar. Una
manera de
inyectar la
muestra es
colocar el capilar
dentro de un vial
con la muestra, y
aplicando presin
al vial, o
succionando por
el otro extremo
del capilar . El uso
de un campo
elctrico para
inyectarla
muestra se
describe en el
texto.

H a g a c lic
en el ico
no
para agr
egar una
imagen

H a g a c lic
en el ico
no
para agr
egar una
imagen
Microfotografas que muestran
a) la imagen fluorescente de
una nica clula intacta,
inmediatamente despus de la
inyeccin del capilar y b)
residuos celulares empezando
a separarse al cabo de 10s
despus de la aplicacin de
una alto voltaje.

-Electroforesis:
cuando ion de carga q(coulombios ) se coloca
en un campo elctrico E(V/m), la fuerza sobre
el ion , es q.e(N).En disolucin la fuerza de
friccin de retardo es f.uef ,donde uef es la
velocidad del ion, y f el coeficiente de friccin
. El subndice ef indica electroforesis. El ion
alcanza casi instantneamente una velocidad
constante cuando la fuerza de aceleracin
iguala a la de friccin .
Uef = qE uefE
f

-Electrosmosis:
En un campo elctrico, los cationes son atrados
por el ctodo, y los aniones por el nodo. El
exceso de cationes en la parte difusa de la doble
capa constituye un momento neto en direccin al
ctodo .Esta accin de bombeo llamada
electrosmosis ,es impulsada por los cationes
solvatados que se encuentran en una franja de
~10nm contigua alas paredes ,y crea una especie
de frente uniforme de flujo electroosmtico de
toda la disolucin hacia el ctodo.

Modo de hacer una electroforesis

capilar
La electroforesis capilar fue una tecnologa que permiti la determinacin
de la secuencia de cidos nucledos en el genoma humano.

-Control del el entorno en el interior del

capilar:
La condicin de la pared interna del capilar es critica en electroforesis.
Controla la velocidad electrosmotica y proporciona centro activos de
adsorcin de molculas con carga mltiple, como la s protenas, se debe
prepara el capilar de slice fundida.

-Influencia de conductividad
apilamiento y banda sesgada:
se elige las condiciones de forma que el analito se
enfoque en forma de bandas estrechas al principio
del capilar por un proceso que se llama apilamiento.
El apilamiento depende de la relacin entre el
campo elctrico en la zona de la muestra inyectada
y de la concentracin del electrolito a ambos lados
de la muestra.

-Detectores:
Dado que el agua es transparente , los detectores ultravioleta pueden operar hasta
longitudes de onda de 185nm,donde la mayora de los solutos presentan fuerte absorcin.

-Electroforesis capilar en gel:

La electroforesis capilar en el gel es una variante de electroforesis en gel, que ha
sido un instrumento primario
en bioqumica durante cuatro dcadas. Los geles de polmeros, usados para
separa macromolculas segn su tamao, han sido habitualmente geles
qumicos , que tenia enlaces qumicos entre las cadenas. Los geles qumicos son
difciles de desalojar de los capilares cuando se presentan un problema, a
diferencia delos geles fsicos, que son polmeros lineales , simplemente enredados
unos con otros , y que son comunes en la actualidad. Los geles fsicos se pueden
extraer y volver a cargar para regenerar un nuevo capilar en cada separacin.

-Laboratorio en un chip

GRACIAS
!