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Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas

Virologia - 29 de Maio de 2015

Journal
Club

Journal of Clinical Virology 42 (2008) 6569

Carina Maia Turma L2| Jeane Cristine Meneses | Joana

Objetivos

Importncia

Deteo
Deteo de
de antignios
antignios virais
virais e
e
Tcnicas de
mtodos
mtodos baseados
baseados em
em tcnicas
tcnicas
diagnstico mais
de
de PCR
PCR
usadas atualmente
A qualidade da amostra importante pois influencia a
sensibilidade da tcnica e consequentemente a deteo dos
vrus.

Mtodos de Obteno das


Amostras

Aspirados Nasofarngeos (NPA)


So os melhores exemplares para a deteco rpida de vrus
respiratrios.
A

obteno

desagradvel

para

paciente,

equipamentos especializados;
Operador qualificado para a colheita da amostra;
difcil de obter em pacientes em ambulatrio

requer
4

Mtodos de Obteno das


Amostras

Zaragatoas (swabs) Nasofarngeos


A (NPS)
comparao entre zaragatoas nasofarngeas e aspirados
nasofarngeos ainda controversa:
Alguns

estudos

indicam

que

com

um

swab

nasofarngeo

se

conseguem obter resultados comparveis aos obtidos pelo NPA;


As amostras obtidas por NPS tm menos celulas epiteliais do que o
NPA (importante para detecao directa de antigenio por ensaio de
imunofluorescncia)

Mtodos de Obteno das


Amostras

Flocked-nasopharyngeal swab
Zaragatoas
(NPFS) modificadas com objetivo de aumentar o n de clulas
epiteliais colhidas e consequentemente proporcionar um melhor
diagnstico.
Proporcionam amostras clnicas melhores quando comparados com
zaragatoas convencionais.
Ainda no h comparaes em relao ao aspirado nasofarngeo

Recolha das Amostras


PACIENTES: 196 crianas
foram

hospitalizadas

de idade inferior a 18 anos que

com

infeces

agudas

do

trato

respiratrio no hospital Queen Mary no perodo entre Fevereiro


a
de 2007
Maio
Protocolo
do estudo aprovado pelo comit de tica do hospital
Queen Mary.
Consentimento informado obtido antes dos indivduos serem
recrutados

Para cada paciente colheu-se um aspirado nasofarngeo (NPA)


de uma narina e uma flocked swab (NPFS) da outra

Recolha das Amostras


Colheita do aspirado nasofarngeo:
Recurso a um aparelho de suco em
vcuo.
Colheita para frasco com 2,5ml de
meio de transporte

Colheita da flocked swab


Clculo da distncia entre as narinas e o lbulo
da orelha do paciente para saber a
profundidade da insero
Insero da zaragatoa na narina em direo
faringe at se sentir resistncia.
Zaragatoa foi rodada 3x para se obterem
clulas epiteliais

Recolha das Amostras

Amostras
Amostras foram
foram
mantidas
mantidas refrigeradas
refrigeradas ee
transportadas
transportadas para
para oo
laboratrio
laboratrio 3h
3h aps
aps
colheita.
colheita.

Diviso
Diviso de
de cada
cada amostra
amostra
em
em duas
duas alquotas
alquotas que
que
foram
foram processadas
processadas da
da
mesma
mesma forma
forma

Uma
Uma alquota
alquota usada
usada no
no
ensaio
ensaio IFD
IFD ee outra
outra
alquota
alquota usada
usada no
no RTRTPCR.
PCR.

Imunofluorescncia Direta (IFD)

Amostra: 196 aspirados nasofarngeos


(NPA) e 196 zaragatoas da nasofaringe
(NPFS)
Kit

utilizado:

IMAGEN

Screen (Oxoid Ely Ltd., UK)

Respiratory

10

Imunofluorescncia Direta (IFD)

11

Imunofluorescncia Direta (IFD)

Controlo positivo (clulas infetadas


com uma estirpe de controlo de cada
um dos vrus)

Controlo

negativo

(clulas

no

infetadas)
Reagente de Screening:

Reagente de controlo negativo

12
Imagem retirada de: http://
www.thermoscientific.com/en/product/oxoid-imagen-respiratory-scr
een-positive-negative-control-slide.html
(26-05-2015)

Informao retirada de. http://


www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/SDG/MBD/MBD%20Documents/Instructions%20For%20Use/IMAGEN/Respiratory%20Screen/X7852.pdf (Acesso a

Imunofluorescncia Direta (IFD)

Reagentes consistindo em anticorpos monoclonais


purificados direcionados contra protenas especficas
dos diferentes vrus.
13

Reverse Transcriptase quantitative PCR


Amostras: 196 aspirados nasofarngeos (NPA) e 196 zaragatoas
da nasofaringe (NPFS)

Pesquisa de Influenza A e B e de RSV por RTqPCR.


Deteo da carga viral.

Two step Reverse


Transcriptase PCR
combinado com um
real time PCR (qPCR)
Imagem retirada de
http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_c
hain_reaction#Two-step_RT-PCR
(24-05-2015)

14

Reverse Transcriptase quantitative PCR


Extrao
Extrao de cidos nucleicos
nucleicos
totais
totais

15

Retirado de: http://www.biomerieux-usa.com/clinical/nuclisens-easymag (Acesso a 23-05-2015)

Reverse Transcriptase quantitative PCR

16

Reverse Transcriptase quantitative PCR


12L RNA
Primers
aleatrios

cDNA
cDNA

Imagem retirada de: https://


www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/18064014 (Acesso a 2305-2015)

17

Reverse Transcriptase quantitative PCR

18

Reverse Transcriptase quantitative PCR

2L cDNA (Influenza A, B e RSV) ou 5L de (ds)DNA para


Adenovrus
FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit (Roche
Diagnostics GmbH, Germany)
0,5M de cada primer
MgCl2

Imagem retirada de: http://


www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-gre
en-qpcr.html
(Acesso a 24-05-2015)

Fluorescence
was
monitored once at
each cycle at the
end of the annealing
phase.
Imagem retirada de: http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/qpcr-real-time-pcr

19

Reverse Transcriptase quantitative PCR


Curva
Curva de
de Calibrao
Calibrao

20

Imagem retirada de: http://


www.sabiosciences.com/pathwaymagazine/pathways7/designing-validati
ng-real-time-pcr-primers.php
(Acesso a 26-05-2015)
Imagem retirada de: https://
www.lifetechnologies.com/pt/en/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-t

Reverse Transcriptase quantitative PCR

21
Retirado de: http://
mededu.cau.ac.kr/micro/research_pds/LC_FastStart_DNA_Master_SYBR_Green_I.pdf (Acesso
a 24-05-2015)

Culturas Celulares

1. Culturas celulares em monocamada


2. Inoculao com 200L de aspirado
nasofarngeo suspenso no meio de
transporte
3. Isolamento dos vrus atravs da
observao do efeito citoptico.

Amostras
196 aspirados
nasofarngeos
Linhas
Linhas celulares
celulares
usadas
usadas
MDCK
LLC-MK2
HEp-2C
RD

22

Resumindo
Imunofluorescncia Direta
Feita em todas amostras de NPA e NPFS
Influenza A e B, RSV, parainfluenza tipo 1,2,3,
adenovrus.

Culturas celulares

Feita para todas amostras de NPA

RT-qPCR
Feita em todas amostras de NPA e NPFS
Pesquisa de Influenza A e B e RSV

RT-PCR ou PCR
Feito para pesquisa de outros vrus quando
surgiram resultados discrepantes

23

Resultados

24

Total= 80

Resultados

Aspirado nasofarngeo (NPA) e flocked swab (NPFS):


excelente sensibilidade (100%) na deteo de influenza A por RTPCR
NPA permite obter uma maior sensibilidade do que NPFS:
Na deteo de RSV por RT-PCR (100% NPA vs. 92,3% NPFS) e por
DIF (87,2% NPA vs. 84,6% NPFS).
Na deteo de influenza A por DIF (90,2% NPA vs. 82,9% NPFS)

25

Resultados

26

Resultados

27

Resultados

74 positivos para
NPA + NPFS
80 positivos no
screening

6 positivos apenas
no NPA
3 Influenza A
Um RSV, um
Adenovrus , um
Parainfluenza tipo 3

N mdio de clulas:
18 (NPA) e 23
(NPFS)

N mdio de clulas
Influenza A 5,5
N de clulas
positivas para os
outros vrus 1

Falsos negativos obtidos no NPFS tinham poucas


clulas positivas

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Discusso

NPFS uma tcnica menos invasiva do que NPA (til em


crianas)
Colheita por NPFS fcil, conveniente e no requer
equipamentos especializados
Colheita por NPFS pode produzir menos aerossis do que o
NPA (que envolve suo) o que diminui o risco de
contaminao

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Bibliografia
[1] Chan, K. H., Peiris, J. S., Lim, W., Nicholls, J. M., & Chiu, S. S. (2008). Comparison of
nasopharyngeal flocked swabs and aspirates for rapid diagnosis of respiratory viruses in
children. J Clin Virol, 42(1), 65-69.
[2] Chan, K. H., Maldeis, N., Pope, W., Yup, A., Ozinskas, A., Gill, J., Seto W.H., Shortridge K.F.,
Peiris, J. S. (2002). Evaluation of the Directigen FluA+B test for rapid diagnosis of influenza
virus type A and B infections. J Clin Microbiol, 40(5), 1675-1680.
[3] Peiris, J. S., Tang, W. H., Chan, K. H., Khong, P. L., Guan, Y., Lau, Y. L., & Chiu, S. S. (2003).
Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong. Emerg
Infect Dis, 9(6), 628-633.
[4] Lo, J. Y., Tsang, T. H., Leung, Y. H., Yeung, E. Y., Wu, T., & Lim, W. W. (2005). Respiratory
infections during SARS outbreak, Hong Kong, 2003. Emerg Infect Dis, 11(11), 1738-1741.
[5] Mitchell, S., O'Neill, H. J., Ong, G. M., Christie, S., Duprex, P., Wyatt, D. E., McCaughey C.,
Armstrong V.J., Feeney S., Metwally L., Coyle, P. V. (2003). Clinical assessment of a generic DNA
amplification assay for the identification of respiratory adenovirus infections. J Clin Virol, 26(3),
331-338.
[6] Gruteke, P., Glas, A. S., Dierdorp, M., Vreede, W. B., Pilon, J. W., & Bruisten, S. M. (2004).
Practical implementation of a multiplex PCR for acute respiratory tract infections in children. J
Clin Microbiol, 42(12), 5596-5603.
30

[7] Templeton, K. E., Scheltinga, S. A., Beersma, M. F., Kroes, A. C., & Claas, E. C. (2004). Rapid

Bibliografia

http://www.copanusa.com/products/collection-transport/floqswabs/ (Acesso a 2305-2015).


Informao sobre flocked swabs

http://www.copanusa.com/files/1814/2352/3834/Copan_FLOQSwab_broch-web.pdf (Acesso a
23-05-2015)
Informao sobre flocked swabs

http://
www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=K612011&c=UK&lang=
EN
(Acesso a 22-05-2015)
Informaes sobre o kit usado no teste de imunofluorescncia (IMAGEN
Respiratory Screen)

http://
www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/SDG/MBD/MBD%20Documents/Instr
uctions%20For%20Use/IMAGEN/Respiratory%20Screen/X7852.pdf
(Acesso a 22-05-2015)
Informaes sobre o kit usado no teste de imunofluorescncia (IMAGEN
Respiratory Screen)

31

http://www.biomerieux-usa.com/clinical/nuclisens-easymag (Acesso a 23-05-

Bibliografia

https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/711_011003_SuperScrpt_
bro.pdf
(Acesso a 23-05-2015)
Informao sobre SuperScript II Reverse Transcriptase

http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-sybr-green-master (Acesso a
23-05-2015)
Informao sobre FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit

http://
mededu.cau.ac.kr/micro/research_pds/LC_FastStart_DNA_Master_SYBR_Green_I.p
df
(Acesso a 24-05-2015)
Informao sobre FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit

http://
lifescience.roche.com/shop/products/lightcycler-faststart-dna-master-sybr-greeni
(Acesso a 24-05-2015)
Informao sobre FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit

https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/vectors/pcriitopo_map.pdf (Acesso
32
a 27-05-2015)

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