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V Simpósio Estadual de Hepatites Virais B e C - CVE

Diagnóstico laboratorial do vírus da Hepatite B

Neiva Sellan Lopes Gonçales


Grupo de Estudos das Hepatites- Disciplina de Moléstias Infecciosas,
Faculdade de Ciências Médicas/UNICAMP
Hemocentro / Unicamp
Prevalência Universal da Hepatite B pode ser decorrência da migração

Número de migrantes por continente de 1996-2002

400 milhões de pessoas infectadas pelo HBV no mundo

50.000 HBV aguda


520.000 mortes/ano
470.000 cirroses e hepatocarcinoma

Kao JH, Chen DS. Lancet Infect Dis, 2: 395-403, 2002


Controle da Hepatite pelo Vírus B

Vacinação
Imunização Passiva
Detecção de portadores do HBV
Tratamento anti-viral
VÍRUS DA HEPATITE B

• Família Hepadnavirus
• Particula esférica 42 nm.
•Esféricas e filamentosas de 17- 25 nm

ESTRUTURA MOLECULAR :

• Envelope viral ( HBsAg)

• Nucleocapsídeo ( HBcAg)

• Genoma viral ( DNA viral)


Virus da Hepatite B e mutações

Replicação do HBV na célula VHB


VHB

HEPATÓCITO

citoplasma Envelopes do HBsAg


DNA-pol
DNA parcialmente duplicado TR

(-) DNA
DNA

RNA m pré-genômico encapsulado

ccc-DNA RNA m

núcleo

 O HBV é altamente replicante (> 1011-13 cópias) e por usar a transcrição reversa (sem
capacidade de correção) para copiar seu DNA,com freqüência emergem cepas mutantes.
 Os “escapes” mutantes do HBsAg surgem independendemente da presença do anti-HBs.
Diagnóstico Laboratorial do HBV

Testes Sorológicos
Princípio dos EIA
Legenda

Ag

Ac

E
Ac +E

E
E

E
Anti-Ac
E
E

E
E

EIA direto (sandwich) EIA indireto EIA competitivo


Marcadores sorológicos e eventos clínicos
em um caso de HVB aguda ictérica

P.I. Fase aguda (ictérica) Fase pós-ictérica

4-26 pródromos icterícia


2 a 18 sem
sem 1 a 2 sem 2 a 12 sem

Sintomas
HBsAg anti-Hbc

HBeAg

IgM anti-HBc

Tempo
Marcadores sorológicos e eventos clínicos
em um caso de HVB em evolução para cura

Fase pós-ictérica

2 a 18 sem

anti-Hbc

IgM anti-HBc

Tempo
Marcadores sorológicos e eventos clínicos
em um caso de HVB curada

Fase de convalescença

anos

anti-Hbc

anti-HBs

anti-HBe

Tempo
Marcadores sorológicos em paciente
vacinada contra a HVB

anos

anti-HBs

Tempo
Marcadores sorológicos e HVB crônica

P.I. Fase aguda (ictérica) Fase pós-ictérica

4-26 pródromos icterícia


sem 1 a 2 sem 2 a 12 sem

Sintomas
HBsAg anti-Hbc

Anti-HBe
HBeAg

IgM anti-HBc

Tempo
Padrão Sorológico Típico da Infecção Oculta pelo VHB

anti-HBc
Título
HBsAg

Tempo
Padrão Sorológico Típico da Infecção Oculta pelo VHB

DNA-VHB positivo no soro ou tecido hepático

anti-HBc
Título

Tempo
Pesquisa do DNA–HBV em doadores de sangue e pacientes co-infectados
pelo HCV/Anti-HBc reagentes e AHIV

N = 100* N =50 N =56


Doadores de sangue Pacientes Pacientes
HBsAg (-)/ Anti-HBcAg(+) HBsAg (-)/ Anti-HBcAg(+)
HCV –RNA (-) HCV-RNA(+) HBsAg (-)/ Anti-HBcAg(+)/AHBs+
HCV-RNA(+)

DNA-HBV (PCR) DNA-HBV (PCR) DNA-HBV (PCR

6 (6%) 94 (94%) 12 (24%) 38 (76%) 3 (5.4%) 53 (94.6%)


DNA-VHB(+) DNA-VHB (-) DNA-VHB(+) DNA-VHB (-)
DNA-VHB(+) DNA-VHB (-)

* 50 AHc/AHBs+ /DNA-VHB -
Gonçales Jr, FL et al.Clin. Diag. Lab. Immun., 10; 718-720, 2003
Pesquisa do DNA–HBV em pacientes HIV + co-infectados ou não pelo HCV

N = 88 N =71
Pacientes Pacientes
HBsAg (-)/ Anti-HBcAg(+) HBsAg (-)/ Anti-HBcAg(+)
HCV –RNA (-) HCV-RNA(+)

DNA-HBV (PCR) DNA-HBV (PCR)

3 (3.4%) 85 (96.6%) 5 (7%) 66 (93%)


DNA-VHB(+) DNA-VHB (-) DNA-VHB(+) DNA-VHB (-)

Gonçales Jr, FL et al.Clin. Diag. Lab. Immun., 10; 718-720, 2003


Interpretação dos Testes Diagnósticos para o HBV

Aguda Exposição Passada Prévia

Teste Hepatitis B (Imunidade) Immunização


HBsAg + – –
anti-HBs – + +
HBeAg + – –
anti-HBe – +/– –
anti-HBc + + –
IgM anti-HBc + – –
* DNA VHB + – –
ALT Elevada Normal Normal
*Por ensaio convencional. Baixos níveis de viremia podem ser detectados por outros testes mais sensíveis como
PCR.

Shetty K and Younossi ZM. Practical Gastroenterology 1998;22(5):39-47.


Interpretação dos Testes Diagnósticos para o VHB

Hepatitis B Pre-core Portador


Teste Crônica Crônico inativo
HBsAg + + +
anti-HBs – – –
HBeAg + – –
anti-HBe – + +
anti-HBc + + +
IgM anti-HBc – – –
* DNA VHB +/- +/- –
ALT Elevada Elevada Normal
* Por ensaios convencionais. Baixos níveis de viremia podem ser detectdos por outros testes mais sensíveis como
PCR.

Shetty K and Younossi ZM. Practical Gastroenterology 1998;22(5):39-47.


Teste
Molecular
PCR quantitativo
PCR qualitativo em tempo real

10 0.000.000 UI/ml
Limite superior de detecção
Limite superior de detecção

2n ( 2 30 =106)

100 cópias/ml

Limite inferior de detecção Limite inferior de detecção

2-10 UI/ml
VGDN
Sequenciador ABI prism 377 Applied Biosystems -FAPESP
GENOTIPAGEM DO HBV

SOROTIPOS E GENÓTIPOS
•SOROTIPOS(4): adw, adr, ayw, e ayr
• GENÓTIPOS: Variabilidade > 8%

• A→H

ELETROFEROGRAMA
Distribuição Global dos Genótipos do HBV
•Casuistica de diferentes regiões do Brasil (SP)
•Genótipo em 103 pacientes com HVB :
A = 49.5 %
B = 2.9 %
AGHD A
G D C C = 13.6 %

H D B D = 24,3 %
E
A F = 9,7 %
Sitnik et al 2004
F AD
A GENÓTIPOS DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) ENTRE PACIENTES
CRONICAMENTE INFECTADOS DA REGIÃO DE CAMPINAS, SP.

A = 54.5 %
B= 0%
C = 2.9 %
D = 35.3%
F = 7.3 %

Detecção Tratamento
Tonetto PA, Gonçales NSL, Souza DS, Feltrin ASC, Gonçales Jr FL , 2006
-FCM-UNICAMP
Genotipagem e
Patogênese

Estudo Europeu Estudo Asiático


Genótipo A x Genótipo D Genótipo B X Genótipo C
• Remissão sustentada > A • Soroconversão precoce > B
• Soroconversão espontânea >B
• Eliminação do HBeAg > A
• Quadro histológico menos intenso: B
• Melhor resposta ao IFN : A • Progressão doença avançada < B
• Hepatites Fulminantes : D • Fator independente – Hepatocarcinoma: C

As evidências até agora encontradas, não permitem colocar a


genotipagem dentro das decisões rotineiras para abordagem e
manuseio clínico dos pacientes infectados pelo VHB.
HBV mutante
GENOMA DO HBV

AgHBs

Pré S1 Pré S2 gene S

DNA Polimerase

gene P

HBcAg HBeAg

gene C Pré C
Mutantes do
HBV
Região do pré-core Região da polimerase
• Nucleotídeo 1896 G→A (G 1896 A) ⇒ • > importância clínica
“stop”prematuro
• Mutação YMDD ⇒ rtM204I/V ± rt L180M
• Freqüente em genótipos B, D, G, H e
alguns C (pareia com T) • ⇒ Resistência à lamivudina ( 17% /ano)
• Não sintetiza HBe e não afeta a • Mutação rt N236T ⇒ resistência ao adefovir
produção de HBcAg • Mutações gene P ⇒ mutações em PréS/S

Região S e PréS
Região promotora do core
•Várias inserções e deleções identificadas.
• Afeta codon de inicialização – A 1762 T e G
• Substituição de Gli por Arg na posição 145
1764 A
- Alteração dos epitopos (HBsAg)
• Diminui a produção de HBe em 70%
(HBeAg negativo) - ↓ afinidade ao anti-HBs
• Comum nos genótipos A, B, C, D - Pressão seletiva de vacinas e HBIg pós Tx
hepático
Conclusã
o:
Imprescindível:

1- a detecção e quantificação do VHB

2- pesquisa dos mutantes em pacientes HBeAg negativos com evidências clínicas e


laboratoriais de doença hepática ativa.
HBeAg + tratar 105 cópias/ml ou 20.000 UI/ml
HBeAg - tratar 104 cópias/ml
1UI/ml= 5.6 cópias/ml

3-pesquisa de mutantes induzidos por tratamento


em pacientes com evidências de doença hepática em atividade, em vigência de
terapêutica
4- Utilização de ensaios para o HBsAg que identifiquem os mutantes da região S mais
comus
Estudos Futuros

Métodos fáceis para detectar mutações


Estudos clínicos e epidemiológicos prospectivos são necessários:
•Monitorar a ocorrência e distribuição dos mutantes
•Para testar o risco de transmissão no indivíduo susceptível e imunizado
•Para detectar esta patogenicidade e a associação com genótipos
Vacinação regular, com vacinas seguras e eficazes.
Ainda não existem evidências de consenso para adição de novos
antígenos à vacina. São necessários mais dados de estudos bem
desenhados para que se estabeleça estas evidências.
Obrigada!
neiva@unicamp.br