Laboratorio de Gentica Clnica

Cultivo de linfocitos y
observacin de cariotipo
humano
Semestre 20161.Grupo 1802. Equipo 5:
Macas Olvera Misael Amir
Quechol Ramrez Gerardo
Torres Jimnez Ramn
Asesor: Raquel Retana
Ugalde

Objetivos
Que el alumno desarrolle experimentalmente
la metodologa que se requiere para realizar
un cultivo de linfocitos de sangre perifrica.
Que el alumno realice y observe
preparaciones semipermanentes de clulas de
cultivo de linfocitos para analizar las
caractersticas de los cromosomas humanos.

Citogentica
Parte de la gentica que
estudia los cromosomas y
las enfermedades
relacionadas causadas por
un nmero o una
estructura anormales de
los mismos.

Cultivo celular
Se entiende por cultivo
celular al conjunto de
tcnicas que permiten el
mantenimiento
de
clulas,
in
vitro,
preservando al mximo
sus
propiedades
fisiolgicas, bioqumicas
y genticas.

Cultivo celular
Se realiza en medios artificiales
preparados mediante la mezcla
de componentes purificados o
de soluciones orgnicas
complejas, en el interior de
instrumentos que mantienen
las condiciones fsico-qumicas
adecuadas y sobre soportes o
recipientes que los contienen y
aslan del medio exterior.

UTILIDAD DE LOS CULTIVOS

CELULARES

Permiten un control preciso y fino del

medio ambiente.
Las clulas en cultivo de una lnea
celular son homogneas, con
morfologa y composicin uniformes
Se pueden obtener con facilidad un
nmero elevado de rplicas idnticas.
Suponen una economa en el uso de
reactivos o drogas a estudiar pues al
realizarse en volmenes reducidos
Es una alternativa viable para el ensayo
in vivo en muchas situaciones.

Cultivo celular
primario
Aislados directamente
de tejidos de
mamferos.
Su crecimiento in vitro
es limitado.
Hay inhibicin por
contacto
(topoinhibicin).

Cultivo celular
secundario
Cuando uno o varios
tipos de clulas de un
cultivo primario se resiembran (sub-cultivo),
el cultivo obtenido se
denomina cultivo
secundario.

Cultivo celular secundario

Lnea Celular
Cultivo celular que tiene alta
capacidad de multiplicarse in
vitro, establecido a partir del
primer subcultivo de un
cultivo primario y que tiene
las mismas caractersticas
que el tejido de origen.

Lnea celular continua: Lnea

celular que ha demostrado
posibilidades
de
ser
subcultivada in vitro por lo
menos
70
veces
(70
subcultivos) indefinidamente.
Lnea celular finita: Lnea
celular que tiene un nmero
limitado
de
posibles
subcultivos (alrededor de 50)

Una de las primeras lneas celulares humanas, obtenida de Henrietta

Lacks, quien falleci de cncer de tero a partir del cual se obtuvieron
estas clulas

El sustrato de cultivo.

Segn si la lnea celular precise o no

unirse al sustrato para proliferar se
dice que es dependiente (adhesin)
o independiente (suspensin) de
anclaje.

Los tipos de sustrato ms empleados

en la actualidad son los siguientes:

Vidrio

Plstico
desechable:
el
ms
empleado es el poliestireno, Otros
plsticos que se emplean son
polivinil-cloruro, policarbonato (PVC),
politetrafluoretileno (tefln, PTFE),
thermanox (TPX).

Microsoportes ("microcarriers"). Se
trata
de
soportes
plsticos
(poliestireno),
de
sephadex
o
poliacrilamida

Placas de Petri

Frascos de Roux

Multiplacas

Roller bottles

La formacin de una lnea celular a

partir de un cultivo primario implica
que:

Aumenta el nmero de clulas obtenidas.

Acaban predominando uno o dos tipos celulares: los

que tienen mayor tasa de crecimiento

La poblacin celular se hace uniforme y homognea.

Sus caractersticas se conservan durante las sucesivas
generaciones y, si se conservan en nitrgeno lquido, de
forma indefinida.

Cultivo de clulas sanguneas

Para propsitos de diagnstico, los
cromosomas son usualmente analizados en
metafases preparadas de cultivo de
linfocitos.
Tambin se utiliza cultivos de fibroblastos de
la piel, amnicitos del liquido amnitico o
clulas de medula sea.
Los linfocitos de sangre perifrica crecen en
un cultivo en suspensin luego de ser
estimulados con fitohemaglutina.

Cultivo de clulas sanguneas

Su periodo de vida es limitado a solo unas
cuantas divisiones.
Requiere de alrededor de 72 horas a 37 C para
dos divisiones celulares.
Se adiciona la sangre directa o se aslan de ella a
los linfocitos T.
Se utiliza heparina para evitar la coagulacin y
que esta interfiera con la proliferacin, heparinasangre 1:20.
Se detiene la mitosis en metafase con colcemida
(derivado de la colchicina) 2h antes de extraerlas.

Laboratorio y equipos para

cultivos de clulas
Cabinas de flujo laminar
Incubadoras
Microscopios
Congeladores y
refrigeradores

Mitgenos
Sustancia que induce la
proliferacin linfocitaria en
forma no especfica.
Las glicoprotenas,
fitohemaglutinina (PHA) y
concanavalina A (Con-A),
estimulan a los linfocitos T.

Fitohemaglutinina (PHA)

Es retirada de una variedad del Phascolus vulgaris.

Esa variedad fue seleccionada, entre las muchas
existentes, buscando obtener actividad mitognica
superior, sin preocuparse con la aglutinacin de los
eritrocitos provocada por las fitohemaglutininas ya
existentes.
Accin: posee excelente grado de actividad
mitognica, siendo suficiente 0,1 - 0,2 ml para
estimular la diferenciacin bsica y la consecuente
mitosis de los linfocitos T presentes en 1 ml de
sangre

Medio de cultivo
Consideraremos que el medio
de cultivo estar formado por
cuatro elementos: la naturaleza
del sustrato o fase en que
crecen
las
clulas,
las
condiciones fsico-qumicas y
fisiolgicas
del
medio,
la
naturaleza y composicin de la
fase gaseosa y las condiciones
de incubacin, especialmente la
humedad y la temperatura.

Los principales medios empleados

y sus aplicaciones son:
Medio Basal de Eagle
(BME). Medio elemental con
slo
los
aminocidos
esenciales.
Se
necesita
siempre la suplementacin
con suero bovino fetal al 10
%.
Crecimiento
de
fibroblastos
de
ratn
y
clulas HeLa.

Medio Mnimo Esencial de

Eagle (MEM).
Es el medio de uso ms
corriente,
contiene
ms
aminocidos
y
en
mayor
concentracin que el BME. Se
usa para cada casi todo tipo de
cultivos y requiere la adicin de
suero (10%).

 RPMI 1640.
Medio
diseado
para
el
crecimiento de linfoblastos y
lneas celulares leucmicas en
suspensin. Tiene un amplio
rango de aplicaciones con
suplementos adecuados.

Medio MEM modificado por

Dulbeco (DMEM).
Contiene
cuatro
veces
la
concentracin de aminocidos y
vitaminas que el BME. Se usa
para la seleccin de hibridomas
suplementado con HAT o HT.

Todo medio de cultivo est formado

por los siguientes elementos:
Soluciones salinas equilibradas (BSS): mezcla
de sales inorgnicas, suplementada con
glucosa.
Aminocidos.
Vitaminas.
Glucosa.
Otros suplementos orgnicos de bajo peso
molecular. nuclesidos, piruvato, lpidos.
Hormonas y factores de crecimiento (suero):
suero de ternera, suero bovino fetal, suero de
caballo y suero humano.

Condiciones para un cultivo de linfocitos

Contaminacin
Uso de campana laminar
Antibiticos vs estreptococos
estafilococos y enterobacterias

72 h: Penicilina (100 U/mL) y Estreptomicina (100

g/mL)

> 72 h: Kanamicina (100 g/mL) y Gentamicina

(50 g/mL)

Polimixina B (100 U/mL) vs Pseudomonas sp.

Antifngicos vs Candida sp y Aspergillus

sp

Nistatina (50 g/mL) y Anfotericina (2.5 g/mL)

Colchicina
La colchicina es un frmaco antimittico
que detiene o inhibe la divisin celular en
metafase o en anafase. Es un compuesto
que evita la distribucin de las
cromtidas de un cromosoma durante la
mitosis, ya que aunque no haya
separacin, s hubo duplicacin previa del
material gentico

Colchicum autumnale

Mecanismos de accin

Acta sobre las protenas

citoesquelticas del huso mittico
denominadas tubulinas.

Al desorganizarse el huso, los

cinetocoros de las cromtidas no
tienen donde unirse y traccionar, lo
cual ocasiona que los cromosomas
no se distribuyan normalmente
durante la divisin celular.

* Actualmente se est utilizando como

anticancerigeno, inhibiendo la rpida
multiplicacin de las clulas tumorales.

Sincronizacin

En un cultivo celular se tienen todas las fases

de la mitosis

Se adiciona metotrexato (MTX) en un estadio

temprano del ciclo celular, este compuesto es
anlogo del cido flico el cual tiene una alta
afinidad por la dihidrofolato reductasa, la cual
participa en la sntesis del cido folnico.

El acido folnico se requiere para la produccin

de timina y por lo tanto la sntesis de DNA.

Las clulas se bloquean entre G1-S, se espera

tiempo suficiente para que se sincronicen las
clulas.

Se retira el bloqueo va exgena con el

nuclesido de timidina o 5-fluoruracilo.

Siembra de Linfocitos

Cosecha de linfocitos

OBSERVACIN