Controle de Qualidade Biolgico e

Microbiolgico de Produtos Farmacuticos

e Cosmticos

Teste de Endotoxinas bacterianas

Prof. Fernando Henrique Andrade
Nogueira

Teste de Endotoxinas bacterianas

considerado um mtodo alternativo ao dos

coelhos (USP XX 1980)

Mais rpido e mais sensvel endotoxina

Teste in vitro ausncia da

fisiolgica do animal ao pirognio.

Dvidas quanto deteo de pirognio no

oriundo de bactrias Gram (-)

resposta

Teste de Endotoxinas bacterianas

O lisado do amebcito do caranguejo Limulus

polyphemus
coagula
em
contato
com
endotoxinas bacterianas

O sangue do
centrifugado

Os amebcitos so separados e lisados com o

uso de soluo hipotnica ou mtodos mecnicos

O lisado ento estabilizado e liofilizado, sendo

estvel por 3 anos a 4 oC

caranguejo

drenado

Teste de Endotoxinas bacterianas

Princpio da tcnica:

Reao enzimtica entre o lisado (LAL) e a

endotoxina resultando em coagulao

Temperatura tima 37 a 39 oC

pH timo 6,0 a 7,0

Teste de Endotoxinas bacterianas

Materiais:

Todos os materiais devem ser apirognicos

(30 minutos a 250 oC ou equivalente)

gua reagente para LAL: deve-se utilizar

gua estril para injetveis ou outra que no
reaja com o LAL no limite de sensibilidade
deste

Teste de Endotoxinas bacterianas

Os reagentes so disponibilizados em kits

Reagente LAL: padronizado para detectar

0,03; 0,06; 0,125 e 0,25 unidades de
endotoxina (UE) por ml

A quantidade de LAL utilizada fixa (0,1 ml)

Pode ser congelado a -4 oC e utilizado em at

4 semanas

Teste de Endotoxinas bacterianas

Endotoxina bacteriana: reconstituir com 5 ml

de gua estril e apirognica e agitar em
vrtex por 5 minutos. Guardar em 2 a 8 oC
por at 4 semanas

So preparadas diluies seriadas do padro

de endotoxina para a determinao da
sensibilidade do lisado (LAL) e para
comparao no teste propriamente dito.

Teste de Endotoxinas bacterianas

Amostra: deve ter o pH ajustado para a faixa

de 6,0 a 7,5; a menos que citado
diferentemente na monografia

Podem
ser
empregadas
solues
apirognicas e estreis de NaOH ou HCl 0,1
M ou mais diludas

Teste de Endotoxinas bacterianas

Mtodo semi-quantitativo
Confirmao da sensibilidade do LAL (antes do
teste)

Sensibilidade do LAL: menor quantidade de

endotoxina detectvel pelo reagente

Teste realizado em quadruplicata

Controle negativo: gua + LAL

Teste de Endotoxinas bacterianas

Confirmao da sensibilidade do LAL (antes do
teste)

Diluies seriadas do padro de endotoxina

compreendendo 0,25; 0,5; 1 e 2 vezes a
sensibilidade rotulada () do lisado

Sensibilidade rotulada do lisado () = 0,12 UE/ml

Concentraes de endotoxina: 0,03; 0,06; 0,12 e
0,24 UE/ml

Teste de Endotoxinas bacterianas

Confirmao da sensibilidade do LAL (antes do
teste)

Incubar por 1 hora a 37 oC

Reao positiva: gel firme mesmo quando

invertido a 180

Reao negativa: no forma gel firme ou

forma gel viscoso que no mantm a
integridade quando invertido

Teste de Endotoxinas bacterianas

Confirmao da sensibilidade do LAL (antes do
teste)

Ponto final maior diluio da endotoxina que

apresenta resultado positivo

Sensibilidade do lisado = antilogaritmo da

mdia dos 4 pontos finais convertidos em log

Deve estar entre 0,5 e 2 vezes a sensibilidade

rotulada do lisado ()

Teste de Endotoxinas bacterianas

Confirmao da sensibilidade do LAL (antes do
teste)

Sensibilidade rotulada do lisado () = 0,12 UE/ml

10-1,075 = 0,08 UE/ml; de acordo (0,06 0,24)

Teste de Endotoxinas bacterianas

Teste propriamente dito

A quantidade do reagente LAL a mesma

em todos os tubos (0,1 ml)

A endotoxina diluda em srie geomtrica

que deve compreender a faixa de 0,5 a 2

A amostra diluda em srie at que o ponto

final seja alcanado

Teste de Endotoxinas bacterianas

Teste propriamente dito

Solues preparadas em duplicata (exceto o

controle negativo)

Agitar levemente os tubos e incubar a 37 oC por

1 hora. Os tubos no podem sofrer vibrao

Reao positiva, negativa e ponto final da

mesma maneira que no teste de sensibilidade do
lisado

Teste de Endotoxinas bacterianas

Teste propriamente dito

Controle negativo: gua + LAL

Controle positivo da amostra: endotoxina +

amostra + LAL verificar a interferncia da
amostra com a sensibilidade do lisado 0,5 a
2

Padro: diluies endotoxina + LAL - 0,5 a 2

Amostra: diluies produto + LAL UE/ml

Teste de Endotoxinas bacterianas

Clculos e interpretao

Sensibilidade do lisado - antilogaritmo da mdia

dos 2 pontos finais convertidos em log

Concentrao de endotoxina na amostra:

sensibilidade rotulada do lisado multiplicado pela
diluio da amostra na ltima reao positiva

A concentrao de endotoxina na amostra deve

ser inferior especificada na monografia
individual

Teste de Endotoxinas bacterianas

Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado () = 0,12 UE/ml
Controle negativo: gua + LAL
Controle positivo da amostra:
Rplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03

Ponto
final

Log10 do ponto
final

0,12

-0,921

0,12

-0,921

10-0,921

mdia = -0,921

= 0,12 UE/ml (0,06 0,24)

Teste de Endotoxinas bacterianas

Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado () = 0,12 UE/ml
Controle positivo padro
Rplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03

Ponto
final

Log10 do ponto
final

0,12

-0,921

0,06

-1,222

mdia = -1,072

10-1,072 = 0,08 UE/ml (0,06 0,24)

Teste de Endotoxinas bacterianas

Exemplo:
Sensibilidade rotulada do lisado ()= 0,12 UE/ml
Amostra: 10-1,054 = 0,088 // 1/0,088 = 11,4
Rplicas 1/2 1/4 1/8

1/16

1/32 1/64

Ponto
final

Log10 do
ponto final

1/8 =
0,125

-0,903

1/16 =
0,0625

-1,204

mdia =
-1,054

Teste de Endotoxinas bacterianas

Clculo da concentrao de endotoxina

Multiplica-se a concentrao de endotoxina

pela sensibilidade do lisado rotulada ()

0,12 x 11,4 = 1,37 UE/ml

Esse valor deve ser inferior ao especificado

na monografia individual

Teste de Endotoxinas bacterianas

Mxima diluio vlida (MDV)

A amostra no pode ser diluda indefinidamente.

Prejuzo da deteco de endotoxina
Limite de endotoxina Concentrao do produto
MDV
Sensibilidade rotulada do lisado

Se o limite expresso em UE/mg ou UE/UI,

utilizar a frmula acima

Se o limite expresso em UE/ml, basta dividi-lo

por

Teste de Endotoxinas bacterianas

Mxima diluio vlida (MDV)

O resultado da diluio da amostra no deve

ser maior que a MDV mais diludo que a
MDV

Pode
se
utilizar
reagente
LAL
de
sensibilidade maior, permitindo solues
Limite de endotoxina Concentrao do produto
amostra
MDV mais diludas
Sensibilidade rotulada do lisado

Teste de Endotoxinas bacterianas

Fatores crticos para o teste utilizando LAL:

Tempo: 60 2 minutos. Temperatura: 37 1 oC

(banho-maria ou estufa)

No expor os tubos a vibraes resultados

falso-negativos

pH: 6,0 a 7,5. Perda de sensibilidade do lisado

Perda de gua por evaporao - concentrao

Teste de Endotoxinas bacterianas

Fatores crticos para o teste utilizando LAL:

Concentrao
adequada
de
ctions
divalentes j adicionados no reagente LAL