RESONANCIA

MAGNTICA
NUCLEAR
Mriam Onrubia
Laura Plaza
Patricia Resa

Resonancia Magntica Nuclear

La RMN es un fenmeno que ocurre
cuando el ncleo de ciertos tomos
inmersos en un campo magntico
esttico, son expuestos a un segundo
campo magntico.
H, 13C, 15N, 31P

Caractersticas RMN
Uso de muestras no cristalizadas estructura en
solucin
Posibilidad de aplicar a molculas sin cristales
disponibles.
Amplio rango de condiciones experimentales
PDB: 16% de protenas determinadas por RMN
Determinacin de estructuras de tamao limitado (3540 KDa)

Mecnica Clsica y Cuntica

E pot B

e
L L
2m

M i
i

e
E
mI B0
2m

= momento magntico dipolar

B = Campo magntico
e = carga del em = massa del tomo o eL = momentos angulares
= cte giromagntica
M = magnetizacin
ml = momento angular de spin

Mecnica Cuntica
Niveles cunticos de la energa en B0:

1
1

E mI B0
2
2

1
1

E mI B0
2
2

E B0

Orientacin de los spins

B0

Poblacin de niveles
energticos

B0
2

N > N

Frecuencia de Larmor

Aplicacin de B1
B0

B1

Relajacin
Bx 0
By 0
Bz B0

Ecuaciones de Bloch
L

T=

=MxB

M i Li
i

L
=

=
T
=

(M
x
B)
t
t

Bx 0
By 0
Bz B0

Ecuaciones de Bloch
M x
M y B0 Mx / T 2
t
M y
M x B0 My / T 2
t
M z
( Mz M 0) / T 1
t

Soluciones

t
T2

t
T2

M x M x0 cos 0t M y0 sen 0t e

M y M x0 sen 0t M y0 cos 0t e

M z M eq M z0 M eq e

t
T1

Representacin de las
ecuaciones de Bloch

Ecuaciones de Bloch
M x
M y B0 Mx / T 2
t
M y
M x B0 My / T 2
t
M z
( Mz M 0) / T 1
t

Soluciones

t
T2

t
T2

M x M x0 cos 0t M y0 sen 0t e

M y M x0 sen 0t M y0 cos 0t e

M z M eq M z0 M eq e

t
T1

Relajacin
T1

T1: longitudinal relaxation

time o spin-lattice
relaxation time
T2: transverse relaxation time
o spin-spin relaxation time

T2 T1

T2

Recoger la seal

Free Induction Decay (FID)

Seal
Transformada
de Fourier

Funcin de onda para cada

sistema spin

Frecuencias

RNM unidimensional

Determinacin estructural de protenas para

RMN
Protenas pequeas (< 10 kDa)
RMN bidimensional basada en experimentos de 1H
La estructura se puede obtener sin necesidad de
enriquecimiento isotpico.
Protenas pequeas-medianas (< 20 kDa)
Marcaje isotpico (15N i 13C)
Experimentos de RMN multidimensionales (3D) de triple
resonancia (1H/13C/15N)
Protenas grandes (> 20 kDa)
Marcaje isotpico (15N i 13C) + deuteracin (50%-70% 2H)
Experimentos de RMN multidimensionales (3D i 4D) de triple
resonancia (1H/13C/15N) sofisticados

RMN bidimensional
1. Obtencin de los espectros de
COSY, TOCSY y NOESY.
2. Asignacin : determinar que Aa hay
en los espectros
3. Determinacin de las distancias
entre Aa
4. Reconstruccin 3D

COSY

Identifica los sistemas de spin caractersticos de los

aminocidos.

B0

Permite, por tanto, identificar los aminocidos.

COSY
t1

t2

HC

HB

HA

HC

HB

HA

HB

HA

90 90

TF
90

90

TF
90

90

t3

TF
90

CH3-CH2-OH

HC

t4

90

HC

TF

HB

HA

COSY

Tiempo de evolucin (t1)

Transformada
de Fourier

t1
t2
1
transformada
de Fourier

2
transformada
de Fourier

t3
t4

NOESY
Tcnica para correlacionar ncleos en el espacio que se encuentran a una
distancia menor de 5.
La diferencia entre los espectros con y sin efecto NOE da lugar al
espectro NOESY. Cuanto mayor es el efecto menor es la distancia.

B0

Permite la identificacin de la posicin especfica de cada aminocido en la

secuencia.

Efecto NOE: Nuclear Overhauser Effect

La irradiacin sobre un ncleo produce

variaciones en la resonancia en los ncleos
vecinos.
Condiciones:

distancia < 5

Saturacin de la resonancia

RMN bidimensional
1. Obtencin de los espectros de
COSY, TOCSY y NOESY.
2. Asignacin : determinar que Aa hay
en los espectros
3. Determinacin de las distancias
entre Aa
4. Reconstruccin 3D

Asignacin
Identificar tipos de Aa en COSY y TOCSY
Identificar en NOESY los Aa de la secuencia
Desplazamientos qumicos en COSY

Asignacin de los sistemas

de spin de los Aa

Asignacin de los sistemas

de spin de los Aa
Experimento 2D COSY
(COrrelation SpectroscopY)

Experiment 2D TOCSY
(TOtal Correlation
SpectroscopY)

CH3
CH3
H
H
NH

Val
O
-HN-CH-CCH
CH3 CH3

Asignacin de los sistemas

de spin de los Aa
CHi

Ni

Ci

Ci

CHi+1

Ni+1

Ci+1

Ci+1

picos correlacin TOCSY, COSY

Ni+2
H

Asignacin de los sistemas

de spin de los Aa

Asignacin de los sistemas

de spin de los Aa
Experiment 2D NOESY
(Nuclear Overhauser
Effect SpectroscopY)
gCH3
gCH3
bH
aH
bH
NH
aH
NH

Val

Ala

O
O
-HN-CH-C- -HN-CH-CCH3
CH
CH3 CH3

y al final de la asignacin ...

H-K1-F2-I3-V4-F5-F6-I7-K8-F9-K10-OH

2D COSY
2D TOCSY
F

F
K

2D NOESY

Asignacin secuencial
KFK

I VF
3 4 5

F IK
6 7 8

8 9 10

I VF F IK
3 4 5 6 7 8

KF I
1 2 3

H- K F I V F F I K F K -OH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

RMN bidimensional
1. Obtencin de los espectros de
COSY, TOCSY y NOESY.
2. Asignacin : determinar que Aa hay
en los espectros
3. Determinacin de las distancias
entre Aa
4. Reconstruccin 3D

Determinacin de las
distancias entre Aa
NOE distancias
NOEs intensos:

1.8 < rHH < 2.8

NOEs medios:

1.8 < rHH < 3.5

NOEs dbiles:

1.8 < rHH < 5

H
H

H H

RMN bidimensional
1. Obtencin de los espectros de
COSY, TOCSY y NOESY.
2. Asignacin : determinar que Aa hay
en los espectros
3. Determinacin de las distancias
entre Aa
4. Reconstruccin 3D

Reconstruccin 3D
ngulos diedros puentes disulfuro
lmites de distancias
entre 1H

Secuencia
protena

Longitudes y
ngulos de enlace
geometra
covalente

restricciones
experimentales

Coordenadas
De los tomos de la
protena

Estructura 3D

quiralidad,
planaridad
Interacciones no covalentes:
van der Waals, electrostticas, enlaces dH

Estructura de protenas

enlace

Estructura de protenas

ngulo
enlace

Estructura de protenas

dihedro
ngulo
enlace

Estructura de protenas

dihedro
ngulo
enlace

van der Waals

Estructura de protenas

dihedro
ngulo
enlace

electrosttico

van der Waals

Estructura de protenas

dihedro
ngulo
enlace

puente de
hidrgeno

electrosttico

van der Waals

Estructura de protenas
NOE
dihedro
ngulo
enlace

puente de
hidrgeno

electrosttico

van der Waals

Fin de la presentacin, haga click si tiene dudas

Parmetros espectrales con informacin sobre

la estructura secundaria de la protena
1.

NOE

2. Constantes de acoplamiento (J)

3. Desplazamientos qumicos ()
4. Velocidades de intercambio H
5. Coeficientes de temperatura

Parmetros espectrales con informacin sobre

la estructura secundaria de la protena
1.

NOE: La irradiacin sobre un ncleo produce

variaciones en la resonancia en los ncleos vecinos.
Condiciones:

distancia < 5

Saturacin de la resonancia para igualar

estados alfa y beta.

Es el mtodo de elucidacin de caractersticas

estructurales en 3D y estereoqumica, usando
RMN junto con informacin de los acoplamientos
escalares spin-spin.

Parmetros espectrales con informacin sobre

la estructura secundaria de la protena
2.

Constantes de acoplamiento spin-spin (J):

Las interacciones escalares entre ncleos unidos
a travs de un pequeo nmero de enlaces
covalentes causan desacoplamiento en las seales
de RMN.
Dependen de la geometra de los enlaces que unen
los spins nucleares.

Parmetros espectrales con informacin sobre

la estructura secundaria de la protena
3.

Desplazamientos qumicos ():

Los diferentes protones de una molcula
presentan frecuencias de resonancia
caracterstica en funcin de su entorno
qumico.

Parmetros espectrales con informacin sobre

la estructura secundaria de la protena
4.

Velocidades de intercambio 1H

5.

Coeficientes de temperatura: permite saber si

se forman puentes de hidrgeno
intramoleculares.

NH / T

H:

1.Cita las caractersticas ms importantes de la tcnica RMN y su definicin.

La RMN es un fenmeno q ocurre cuando el ncleo de ciertos tomos inmersos en
un campo magntico esttico, son expuestos a un segundo campo magntico. Solo
sufren este fenmeno los ncleos que tiene la propiedad llamada SPIN. Ncleos q
tienen esta propiedad de spin son 1H, 13C, 15N.
Solo los q tienen spin distinto de 0 son detectables por RMN.
Caractersticas:
- Las estructuras a estudiar estn en solucin, como suelen estar en su medio
habitual.
- Posibilidad de aplicar a molculas sin cristales disponibles.
- Amplio rango de condiciones experimentales. Esto permite aumentar las
posibilidades de estudios comparativos en soluciones de condiciones naturales o
desnaturalizantes.
- Tambin se pueden estudiar con esta tcnica protenas no solubles: con RMN
slido o con micelas. (para por ejemplo el estudio de prot. Transmembrana).
- PDB: 16% de protenas determinadas por RMN
- Determinacin de estructuras de tamao limitado (35-40 KDa)

2. En que consiste el efecto NOE y que aplicaciones podemos encontrarle?

Efecto NOE: la saturacin de un sistema spin mediante irradiacin producir variaciones en
la seal emitida por los sistemas spin vecinos.
Se basa en saturar uno de los sistemas spin de la muestra. Si seguimos irradiando este sistema
spin concreto durante un periodo de tiempo ms largo, este no puede absorber esta energa de
ms y la cede a los sistema spin vecinos situados a menos de 5 amstrongs que s podrn
absorber esta energa. Comparando las frecuencias obtenidas habiendo producido o no efecto
NOE, podremos deducir que sistemas spin estn a 5 amstrongs o menos de distancia.
Aplicaciones Experimento NOESY: Nos permite comparar espectros obtenidos habiendo
producido el efecto NOE y sin producirlo, de manera que podemos comparar que sistemas de
spin quedan afectados por otros sistemas de spin cercanos.
Teniendo en cuenta que cada aminocido tienen un sistema de spin caracterstico, podemos
relacionar sistemas spins vecinos separados por enlaces peptdicos (doble enlace), es decir,
podemos relacionar aminocidos vecinos. Esto nos permite conocer la secuencia de una
protena.

1.
2.
3.
4.

PEM:
1. Seala les opciones correctas:
a)
Solo los tomos con sistema de spin diferente de 0 son detectables por RMN.
b) Tienen propiedad de spin los tomos con un nmero de electrones impar y/o con un nmero de neutrones impar.
c)
Las dos anteriores son correctas.
d) Cualquier tipo de tomo presenta propiedad de spin.
e) Todas las anteriores son correctas.

2. Seala las verdaderas. Sobre RMN (Resonancia Magntico Nuclear)...

Una de las principales ventajas del RMN es que no es necesario cristalizar la molcula en estudio.
Se pueden hacer RMN en medio slido.
El hecho de que se puedan hacer RMN con micelas, permite el estudio de protenas transmembrana en un medio similar al que se
encuentran en condiciones normales.
Uno de los principales inconvenientes es que el tamao de las protenas que se pueden estudiar es limitado.
a)
b)
c)
d)
e)

1, 2 i 3
1i3
2i4
4.
1, 2, 3 i 4

3.Cul de estas es una caracterstica de la RMN? indica la opcin correcta:

a)
b)
c)
d)
e)

Las muestras deben estar cristalizadas.

Las condiciones experimentales vienen muy detalladas y las condiciones son muy limitadas.
Es posible para cualquier tipo de molculas sin importar el tamao.
Se pueden utilizar micelas para protenas no solubles.
Ninguna de las anteriores es una caracterstica del RMN.

4. Indica la opcin correcta. El RMN unidimensional nos sirve para...

a)
b)
c)
d)
e)

Determinar si existe mucho solapamiento entre frecuencias, indicando si debemos hacer RMN 3D.
Se usa como indicativo de la calidad que tendr el estudio en 2D.
Indica frecuencias y su posicin depende del desplazamiento qumico.
Todas las anteriores son correctas.
Ninguna de las anteriores es correcta.

5. Seala la afirmacin incorrecta:

a)
Las ecuaciones de Bloch describen la relajacin del sistema de spin al dejar de aplicar el segundo campo magntico
b) La frecuencia a la que precesan (giran) los sistemas de spin es completamente irrelevante.
c)
El nivel energtico en el que se encuentre un tomo sometido a una campo magntico depende del momento angular de spin.
d) El momento magntico bipolar () es directamente proporcional a la carga e inversamente proporcional a la masa.
e) Todas las anteriores son correctas.

6.Seala las verdaderas. Sobre RMN (Ressonncia Magntico Nuclear)...

1. El experimento COSY permite ver interacciones entre sistemas de spin de distintos Aminocidos.
2. El experimento NOESY permite ver interacciones entre sistemas de spin de distintos Aminocidos.
3. El experimento COSY permite ver interacciones entre sistemas de spin alejados ms de 5 amstrongs.
4. El experimento NOESY permite ver interacciones entre sistemas de spin separados por un doble enlace.
a)
1, 2 i 3
b) 1 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e)
1, 2, 3 i 4

7. Indica las verdaderas.

a)
Un experimento NOESY proporciona ms informacin que uno COSY.
b) El primer paso del anlisis de los resultados de los experimentos de RMN es la asignacin ( saber cada sistema de spin a que
aminocido corresponde).
c)
Las dos anteriores son correctas.
d) El experimento NOESY nos proporciona las restricciones de distancia entre amnocidos, de manera que es el que realmente nos da
la informacin sobre la estructura secundaria y terciaria de la protena.
e) Todas las anteriores son correctas.
8. En el experimento NOESY:
1. Dado que las protenas tienen cierto movimiento en solucin, las distancias no van a ser nmeros exactos
2. La lista de distancias obtenidas con un NOESY va a ser esencial para hacer la reconstruccin 3D.
3. Se utilizan una serie de rangos para definir las distancias entre sistemas de spin, el mnimo de los cuales coincide con la suma de los
radios de las fuerzas de Van der Wals.
4. Cuanto ms intenso sea el pico obtenido en un espectro NOESY, ms lejos estn los aminocidos implicados.
a)
b)
c)
d)
e)

1, 2 i 3
1i3
2i4
4
1, 2, 3 i 4

9. Qu informacin no va a utilizar el ordenador para hacer la reconstruccin 3D?

a)
b)
c)
d)
e)

La geometra covalente (longitudes y ngulos de enlace, quiralidad y polaridad).

La secuencia de la protena.
Una lista con el nmero de aminocidos de cada tipo obtenida con el TOCSY.
Las interacciones no covalentes (fuerzas de Van der Wals, enlaces de H...)
Los lmites de distancias obtenidos con el NOESY.

10. En cuanto a la asignacin en RMN:

1. Con los espectros de COSY identificaremos qu y cuntos aminocidos hay en nuestra protena
problema.
2. El NOESY nos permitir determinar los aminocidos vecinos por estructura y por secuencia.
3. El NOESY es til para distinguir entre hlices alfa y beta.
4. Cada aminocido tiene una distribucin de picos caracterstica en un espectro COSY.
a)
b)
c)
d)
e)

1, 2 i 3
1i3
2i4
4.
1, 2, 3 i 4