TCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

Prof. MsC. Moezio de Vasconcellos Costa Santos Filho

Macei - 2014

HISTRICO
Watson & Crick
Estrutura do
qumica do DNA
(1953)

Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)

Ian Wilmut

clonagem de mamfero
(1997)

HISTRICO
PGH

Conhecer genoma H. sapiens

(1995-2003)

Transgenia
(1995...)

Prtica clnica
Testes genticos
(1995...)

ENZIMAS

DNA Polimerase;
RNA Polimerase;
DNA Helicase;
Endonuclease de Restrio;
(Stio-especficas)

DNA Ligase;
Taq DNA Polimerase;
Poli-A Polimerase;
DNAses/Nucleases.
(sem stios especficos)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Fundamentos e objetivos
Amplificao exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro;
Resoluo dos problemas da baixa quantidade e degradao;
Amplificao exponencial por alterao de temperatura.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Etapas
Desnaturao: double strand separadas (95C);
Anelamento: Ligao dos primers na single strand (56C);
Extenso: Produo da fita complementar pela DNA-polimerase (72C).

Vdeo

Endonucleases de Restrio
Descritas em 1970,
W. Alber

H. Smith

D. Nathans

Uma enzima de restrio ou endonuclease de restrio

um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA
sempre que identificar uma seqncia particular de
nucleotdios que seja o stio de restrio da enzima.

 Nomenclatura
Bam HI - Bacillus amyloliquefaciens
5 G/GATCC 3
Eco RI - Escherichia coli
5 G/AATTC 3
Hae III - Haemophilus aegyptius
5 GG/CC
3
Pst I - Providencia stuartii
5 CTGCA/G 3

370 C, 1 hora,
com tampo
adequado

Extremos coesivos

Extremos rombos

Clonagem Molecular
Utilizao de bactrias;
Plasmdeos como alvos;
Endonucleases de restrio;
Clonagem de genes responsveis por protenas importantes ou
escassas em determinado organismo.

Clonagem Molecular

CLONAGEM MOLECULAR

o isolamento e a propagao
em
um
organismo
de
molculas idnticas de DNA.

Vdeo

 Nem todas as protenas so como a insulina;

As membranas so impermeveis a grandes molculas.

Devido a morte por terapia gnica

1- O gene deve ter sido bem caracterizado (clonado e amplificado).

Deve est disponvel em forma pura;
2- Deve est disponvel um mtodo eficiente para introduzir o(s)
gene(s) nos tecidos ou clulas desejadas;
3- Os riscos da terapia gnica para o paciente devem ter sido
cuidadosamente avaliados e demonstrados como mnimos;
4- A doena no deve ser tratvel por outras estratgias;
5- Devem estar disponveis dados de experimentos preliminares
com modelos animais ou clulas humanas e deve ser indicado
que a terapia gnica proposta deve ser eficaz.

Obs.: Clulas Somticas

No cura a doena,
somente a controla

Figura 17.8

Figura 17.13

hGH
Fator VIII
Insulina
Obs.: Transgene

Microinjeo de DNA

Figura 17.14

Ocorre em clulas germinativas

G0 DNA inserido antes da fuso nuclear

(Mosaicos Genticos)

G1 Transgene em todas as clulas

Antes da Terapia Gnica

hGH
Bovinos e sunos incompatveis;
Primatas e cadveres humanos compatveis.

Plantas
Clulas vegetais Totipotncia;
Retorno ao estado embrionrio;
No existe separao em linhagem germinativa e clulas somticas.

Agrobacterium tumefaciens
Sistema natural de Engenharia Gentica;
Plasmdeo Ti;
T-DNA.

- Bombardeio de microprojteis;
- Eletroporao.
17.16

- Transformao mediada por

Agrobacterium tumefaciens.

 T-DNA - Atinge cromossomos vegetais causando o tumor;

Clulas com T-DNA - sem controle de diviso;
Identificao dos genes tumorais em T-DNA

Figura 17.18

Figura 17.17

200 kb