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ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay


Marcelo Augusto Graduando em Biomedicina| Prof:Carolina Brito| Faculdade Estcio de So Lus

ELISA
Estudo apresentado pelos alunos do 5 perodo do curso de Biomedicina a disciplina de
Imunologia, ministrada pela Prof. Caroline Brito

Componentes:
Aline Santos Fontenele
Felipe Baldez
Luisa Helena do Nascimento Pereira
Marcelo Augusto Ferreira Barros
Rosangela

Definio
um teste imunoenzimtico que permite a deteco de anticorpos
especficos.
Este teste usado no diagnstico de vrias doenas que induzem a
produo de imunoglobulinas.
O complexo que contm o anticorpo visualizado pelo acoplamento da
enzima ao anticorpo.
A adio de substrato ao complexo enzima-anticorpo-antgeno resulta num
produto colorido, que lido por um equipamento especfico.

Princpio
Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples,
chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de
ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex.
soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno. Se houver
anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao antgenoanticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um segundo
anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar
os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este
anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se
o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma
substancia qumica que d uma reao colorida quando H2O2
desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo
apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato).

Diagnstico
Geral
Vrias doenas
infecciosas, uma vez
que a maioria dos
agentes patolgicos
desencadeia a
produo de
imunoglobulinas.
Tambm pode ser
usado no diagnstico
de
doenas auto-imunes
ou alergias.

HIV

Imunoradioensaio

Este o teste de primeira


linha no diagnstico da
infeco pelo HIV
Detectam tanto anticorpos
quanto um dos antgenos
do HIV (a protena p24)
Um resultado reagente
num teste de HIV por
ELISA sempre
confirmado por outros
testes especficos, como
o caso do Western blot e
do PCR

O teste ELISA tambm pode


ser utilizado de diversas
outras formas. Utilizando-se
de um mtodo semelhante
ao mtodo de
imunoradioensaio, pode-se
transformar muitas outras
substncias em antgeno e
obter um anticorpo do
mesmo.
Assim, possvel utilizar o
teste para se detectar outras
substncias de interesse
como, por exemplo,
hormnios.

Mtodo*
1 Sensibilizar as placas de ELISA com o antgeno, previamente diludo, em tampo
carbonato, 100 ul por orifcio, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitir a ligao do antgeno
placa.
2- No dia seguinte, remover a soluo de antgeno e lavar a placa 3 vezes com lquido de
lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifcio.
3- A placa pode ento ser armazenada para uso posterior (em sacos plsticos fechados a 20
oC, ou utilizada imediatamente.
4- Acrescentar os soros a testar em uma diluio previamente determinada ( em nosso
exemplo), preparada em lquido de lavagem, em volumes de 100 ul/orifcio. Incubar por uma
hora a 37 oC.
5- Remover a diluio dos soros e lavar trs vezes com lquido de lavagem.
6- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do anticorpo monoclonal (1:1000
em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
*SIMULAO

Mtodo*
7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar trs vezes com lquido de lavagem.
8- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do conjugado (anti-IgG de
camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem. Incubar por
uma hora a 37 oC.
9- Remover a diluio de conjugado e lavar trs vezes com lquido de lavagem.
10- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma soluo de OPD (ortofenilenodiamina) preparada
em tampo citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37
oC.
11- A reao interrompida pela adio de 50 ml por orifcio de uma soluo de H2SO4 2M.
12- Os resultados so obtidos com base na leitura da densidade tica (D.O.) em
espectrofotmetro com filtro de 492 nm.
*SIMULAO

Outro mtodo o chamado ELISA de bloqueio ou competio, em que a


presena de anticorpos em determinado soro revelada pela competio
com um anticorpo especfico (mono ou policlonal) dirigido contra o antgeno.
Igualmente, o resultado dado pela adio de um conjugado, porm
a colorao aparecer nos poos onde no havia anticorpos.

Leitura do resultado
Um teste positivo visvel ao olho nu, sendo que a cor, geralmente,
amarelo ou azul. Mas o resultado no liberado apenas no olhmetro.
necessrio quantificar o resultado, e por isso existem os leitores de ELISA.
Cada tipo de exame tem um protocolo de clculo diferente. Geralmente, toda
vez que se abre um novo kit, necessrio fazer uma curva de
calibrao com todos padres que vm juntos. O aparelho pode liberar o
resultado j pronto ou, dependendo do exame, ele ir liberar apenas o valor
da absorbncia e o biomdico ter que fazer os clculos manualmente.