Biotecnologia Farmacutica

Biotecnologia Microbiana:
Produo de Penicilina
Docente:
Cllia Afonso
Trabalho elaborado por:
Dora Silva
Mrcia Santos
Maria Santos
Biologia Marinha e Biotecnologia
Peniche, 3 de Junho de 2008

Introduo
Introduo de antibiticos em medicina foi uma das maiores descobertas
da e para a Humanidade

Incio de uma nova era

Doenas mortais passaram a ter cura

Discute-se a descoberta da penicilina

Fermentao
Extraco dos caldos fermentados
Modificao qumica

A descoberta dos antibiticos por fermentao foi na indstria

farmacutica: o primeiro exemplo de biotecnologia.

Introduo
Apesar da produo a larga
escala da penicilina, da elevada
importncia

comercial

apresenta e de ser

produzido h mais tempo por

,

fermentativo

conhecido

insuficiente, devido a:

de controlo metablico

que

a que

fermentao

o Modificao gentica dos mecanismos

processo

Acentua determinadas caractersticas

de uma estirpe

Produtividade

o Formulao a priori de meios e

condies de cultura mais adequadas a
dada estirpe.

Este antibitico foi descoberto atravs do

processo fermentativo (no qumico)do fungo

Penicillum chrysogenum

Pode-se sintetizar diversos antibiticos.

Descoberta e Produo Industrial de

Penicilina
A descoberta da penicilina foi realizada por Sir Alexander Fleming em 1928,

descobertas por factores experimentais desconhecidos ou no-controlados

Devido Segunda Guerra Mundial, Chain e Florey comearam a trabalhar
na aplicao clnica desde 1938, no entanto s comeou a ser produzida
em larga escala, nos Estados Unidos da Amrica em 1941.
Apesar disto

O seu trabalho foi reconhecido: na Holanda atravs de

investigaes clandestinas e em Espanha devido s necessidades
provocadas pela guerra civil

Fleming,

Chain

Florey

receberam em 1945 o Prmio

Nobel da Medicina

O Paradigma da Produo Industrial

de Penicilina

Na primeira metade dos anos 40, a quantidade de penicilina produzida, nos

EUA, era muito reduzida. No entanto, aps a Segunda Guerra Mundial, a sua
produo aumentou 500% (devido propaganda publicitria).
Desde ento

Atualmente:20000 ton/ano
Investigao
desenvolvimento

Aps a descoberta da Penicilina

e Descobriram-se mais de 8000 novos antibiticos

de

processos industriais e
de engenharia gentica

Actualmente

paradigma

170 antibiticos por fermentao

e posterior modificao qumica

# seleco de estirpes
# optimizao escala laboratorial das condies de fermentao
# teste em instalaes piloto
# soluo emprica de problemas de aumento de escala
# caracterizao qumica e estrutural do composto activo
# modificao qumica do composto activo
# deste de formulaes em animais e seres humanos
# produo industrial do antibitico

Tanta complexidade devida:

-Complexidade bioqumica
- Persistncia de problemas
fundamentais, presentes nestes
processos

As principais Penicilinas e Derivados

Composio geral das penicilinas
O ncleo comum a todas as penicilinas o cido 6-amino
penicilnico (6-APA)
Contm um anel de 4 membros, ao qual se designa por beta-lactmico e um anel de
5 membros designado por anel tiazolidinico.
O radical R permite dar o nome respectiva penicilina que representa.
Penicilinas
com
interesse industrial

Penicilina G (benzilpenicilina)
Penicilina V (fenoximetilpenicilina)

A obteno de uma determinada penicilina est

relacionada com o fornecimento da cadeia lateral durante
a fermentao em fed-batch.

O fornecimento de sais de cido fenil actico (AFA) formao

O fornecimento de sais de cido fexoni actico (AFNA)

Penicilina G

formao

Penicilina V

As principais Penicilinas e Derivados

Penicilina G (Benzil Penicilina)
Frmula
Matria prima para as snteses de 6-APA, 7-ADCA penicilina entre outros;
Substncia teraputica em medicina e veterinria;

Utilidade

Altamente activa contra:bactrias Gram (+) como a Streptococcus pyogenes, Gram

(-) como Bacillus anthracis, Treponema pallidum;
Administrada por injeco;
Promotor de crescimento em feed de aditivos para porcos e galinhas.

Penicilina V (Fenoximetil Penicilina)

Frmula
Matria prima para as snteses de 6-APA, 7-ADCA, cefalor e outros derivados;

Utilidade

Substncias teraputicas oralmente activas contra bactrias Gram (+) como a

Streptococcus pyogenes e Gram (-) cocci;
menos activa que a anterior, mas uma terapia efectiva, quando os organismos
so sensveis a ele.

Penicilinas Semi-sintticas e Derivados

O 6-APA um composto biologicamente inactivo, previamente detectado em
fermentaes de penicilina
Na produo de penicilinas semi-sintticas, o
ncleo activo da penicilina (6-APA), sintetizado
por condensao atravs de vrios compostos
formando
cada um contendo um radical.

Era
inexistente
a
presena de precursor

Penicilina semi-sinttica
particular

Produo de Penicilinas Semi-sintticas

As experincias para obter o 6-APA, biolgicamente,no foram bem sucedidas,
sendo ento soluccionado o problema por mtodos qumicos de elevado rendimento.
Este mtodo

Envolvia: compostos txicos e corrosivos, e

temperaturas da ordem dos - 30 a 40C
Mais tarde, foi desenvolvido um mtodo enzimtico, utilizando enzimas imobilizadas
que produziam 6-APA

A partir da penicilina G
A partir da penicilina V

Mtodo menos txico e

menos poluente

Penicilinas Semi-sintticas e Derivados

Penicilina G
Penicilina V

hidrolizada
Penicilina G sintetase
hidrolizada
Penicilina V sintetase

6-APA
6-APA

As penicilinas semi-sintticas so antibiticos de largo espectro e resistentes a pH

baixo (no so resistentes a -lactamases).

Produo de Desacetoxicefalosporinas
So antibiticos de largo espectro, que
funcionam a pH baixo e com alguma
resistncia a -lactamases.
Obtm-se pela condensao de compostos
de um derivado de penicilina
cido 7 aminodesatoxicefalospornico ou 7-ADCA
Enzimaticamente utilizando a
mesma enzima que hidrolisa a
Penicilina G a 6-APA.

A) Mtodo de sntese qumica

B) Mtodo misto, onde a hidrlise
da Cefalosporina G

Penicilinas Semi-sintticas e Derivados

Produo de Cefaclor e Cefroxadina
So frmacos produzidos
atravs de processos de sntese
qumica a partir da penicilina V.
pH baixo

Largo espectro

Resistncia a -lactamases

Cefaclor muito semelhante cefalexina

Diferenas

Cefaclor na posio 3 tem um tomo de Cl;

Cefalexina na posio 3 tem um tomo de CH3;

Cefalexina muito semelhante cefradina

Cefroxadina na posio 3 tem um tomo de OCH3;
Cefradina na posio 3 tem um tomo de CH3;

Diferenas

Fermentao de penicilinas

A fermentao da Penicilina G e V feita, industrialmente, segundo as

condies:

Reactores agitados
Reactores com arejamento
Reactores operados em fed-batch

Vantagens:

1.Permite um melhor controlo das condies de fermentao

2.Permite manter ao mesmo tempo as condies de fermentao em estado quase-estacionrio e a cultura
em estado vivel, prolongando a durao da fermentao
3.Permite operar o fermentador entre os limites superior e inferior de actividade catablica
4.Permite operar abaixo dos nveis de inibio/toxicidade por substncias essnciais biossntese
5.Reduz a durao da fase de crescimento
6.Permite operar a concentraes de biomassa elevadas e constantes
7.Permite repr a gua evaporada com o arejamento da cultura, evitando o aumento de viscosidade do meio

Processo de fermentao

4 dias depois

100 ml meio +
Espros de P. chrysogenum

Fermentao com
agitao, a 25C

Inocula-se o caldo resultante em

bales de 2L
Utiliza-se este caldo como inculo para uma
nova fermentao
2 dias;Tanques de 100L de meio com
arejamento, arrefecimento e controlo de pH e
temperatura

3 dias depois

Tanques de 120 m3 de
meio

Tanques de 500L de
meio

Condies de
fermentao

Meios de cultura

Formulados com matrias

primas com fontes de C e N
Adiciona-se
diversas
substncias at ao fim da
fermentao:
Acares (glucose ou
sacarose)
Sais
Gorduras
Correctores de pH
Etc

pH 6.5
Temperatura 25 27C
Velocidade de arejamento entre 0,5 e
1,0 m3 de ar / m3 de meio / min (vvm)
(120 150 rpm)
Devido ao aumento de volume durante
a fermentao, faz-se descargas
periodicas de meio j fermentado que
iro ser processadas com a descarga
final do fermentador

Objectivo desta
alimentao
No final:

Reduz ao mnimo a lise celular o

que faz com que a concentrao
de
biomassa
se
mantenha
constante na fase de produo
Figura 1:Perfis de concentrao principais das espcies numa
fermentao semi-descontnua
de penicilina G

Metabolismo secundrio

1 - Condensao do cido
aminoadpico ( AAA) +
cistena + valina = tripptido (-aminoadipil)cistenilvalina
(AVC)
2 - O tripptido ciclizado e
forma isopenicilina-N (IPN)

Primeiro composto
com actividade
antimicrobiana

3 - Ligao do fenilacetato
4 - Produo de Penicilina G

2
3
4

Figura 2:A biossntese de penicilina-G pelo P. chrysogenum.

Caractersticas da estirpes

A biossntese de penicilina envolve 3 genes que do origem a 3 enzimas

Do origem a um cluster que faz antever o aumento de produtividade

porque h amplificao dos 3 genes
Isto leva a crer que o organismo constitui reservas diferenciadas de
aminocidos segundo a biossntes de protenas ou penicilina, mas dispe
de mecanismos de troca entre os diferentes reservatrios intracelulares.
Alm disto, o aumento de troca entre os compartimentos, leva ao aumento
de produtividade.
-Represso catablica por fontes de C e N facilmente metabolizadas

A elevada
produtividade das
estirpes industriais
deve-se:

-Regulao do fosfato
-Produzem e acumulam mais quantidades de precursores e intermedirios
do metabolismo secundrio
-Acumulam maior concentrao intracelular de enzimas biossintticas
-Excretam mais 6-APA
-No oxidam o precursor

Isolamento da Penicilina dos caldos

fermentados
O isolamento de Penicilina G e V:
Extraco

Cristalizao

No fim da fermentao, o caldo fermentado (com ou sem descargas parciais)

Arrefecimento a Temperaturas < 10C

Sector de extraco adio de % formol

0,5 a 1% leva
inactivao do
microrganismo

Tem por objectivo evitar a degradao da penicilina pela presena de betalactamases.

Extraco dos Caldos fermentados

Objectivo

Obter um solvente rico em penicilina (acetato de

butilo), a partir do qual se isola o antibitico).

Rendimento global independente do mtodo utilizado 85/90%.

Obteno de uma soluo rica do antibitico no acetato de

butilo:
Extraco usando filtros rotativos e extractores contnuos
PODBIELNIAK
Extractores decantadores (WHOLE BROTH EXTRACTORS)
Combinao de sistemas de membranas com extractores contnuos
tipo PODBIELNIAK

Extraco usando filtros rotativos e extractores

contnuos PODBIELNIAK
Caldo fermentado
pH =6,5
T= 10C

www.machineryandequipment.com

Filtros rotativos sob vcuo de tipo especial string

discarge filters

Separao slido/lquido

Durante a filtrao
Bolo do filtro lavado com gua
O filtrado emerge do filtro [ ] de penicilina na ordem dos 20.000 U/ml

Rendimento
= 90/95%.

Extraco da Penicilina: utilizao de solventes imiscveis com a gua acetato de butilo.

- pH=210;
- extraco em contracorrente em extractores contnuos de vrios andares.
- necessidade caudal e rendimento grupos de mquinas em srie.

Extractores decantadores (WHOLE BROTH

EXTRACTORS)
Permitem extrair directamente
(habitualmente acetato de butilo);

do

caldo

fermentado

para

solvente

As mquinas, normalmente, so colocadas em srie;

o rendimento do bolo do filtro/filtrado depende do nmero de mquinas em srie;
A separao no extractor decantador origina um solvente, com algum grau
de turvao
A montante existe um clarificador do tipo separador lquido/lquido.

Extraco da Penicilina: processa-se nas mesmas condies do anterior.

O rendimento da extraco calculada para se obter um solvente rico contendo cerca de
70.000 U/ml de penicilina.

Esquema da extraco usando dois extractores decantadores em srie.

Combinao de sistemas de membranas com

extractores contnuos tipo PODBIELNIAK
Sistema menos utilizado;
Constitui opo vlida;
Separao slido/lquido em antibiticos que necessitam de utilizar adjuvante de filtrao
na filtrao convencional

Penicilina

O sistema de filtrao por membranas para a

separao slido/lquido deve incluir microfiltrao
com diafiltrao 1 operao de filtrao.

Factor de diluio elevado, seguindo-se uma concentrao do caldo filtrado por:

- nanofiltrao

Mais vantajoso:

- osmose inversa.

A grande maioria dos sais inorgnicos sero

eliminados atravs da membrana (em osmose
inversa no acontece).

Aps obteno do caldo filtrado rico em penicilina 90/95% - a

extraco efectuada para acetato de butilo em PODBIELNIAK
(1 alternativa)

Cristalizao da penicilina (G ou V)
O processo de cristalizao mais utilizado permite obter Penicilina G
potssica de excelente qualidade

O acetato de butilo rico em Penicilina descolorado com carvo activado

(o qual removido por filtrao)

O pH do solvente purificado acertado a 6,2 6,5 (com adio de

bicarbonato de potssio a 23%)
fase orgnica
Recuperao do
solvente

fase aquosa
Contm penicilina extrada que vai ser
processada para cristalizao pela adio de 4
volumes de n-butanol, seguido de destilao a
baixa presso e baixa temperatura

Para no degradar a penicilina

Cristalizao da penicilina (G ou V)

O butanol existente no evaporador/cristalizador tem uma humidade

inferior a 1%

A destilao termina
a suspenso dos cristais de penicilina
potssica enviada para filtros adequados

Filtrao
os cristais so lavados com metanol e depois de
secos com ar so descarregados para secadores

Aps a secagem, so peneirados, misturados, embalados e analisados

Concluso

Ao longo de 50 anos a fermentao de penicilina aumentou cerca de 5

ordens de grandeza

Actualmente a penicilina tem:

Valor teraputico intrnseco formulaes veterinrias
Matria-prima para produo de outros antibiticos mais eficazes do ponto
de vista bacteriano, estabilidade a pH baixos e a resistncia a -lactamases

A resistncia a -lactamases pode ainda ser aumentada atravs de

compostos inibidores das mesmas ( cido clavulnico, sulbactam e o
tazobactam)
Este aspecto assegura o mercado das Penicilinas