Teoria Curso Practico HPLC

Antecedentes:
anlisis capilar de colorantes

En 1861 se public el tratado anlisis capilar
El descubrimiento: Tswett y pigmentos vegetales
TSWETT 1903. Separacin de pigmentos vegetales mediante una
columna de carbonato clcico.
Khun y Lederer 1930. Separacin de pigmentos mediante almina y
carbonato. Desarrollo de la Cromatografa en capa fina como tcnica
analtica.
Cromatografa de reparto
Martin y Synge (1941) aplicaron tcnicas cromatogrficas para
estudiar la composicin de aa en lana. Emplearon un mtodo por
el cual un lquido (agua) era firmemente enlazado a un slido
granulado (gel de slice) y se empaquetaba en un tubo de vidrio.
Un segundo lquido inmiscible (cloroformo) era pasado a travs de
la columna.
Cromatografa en papel y capa fina
Martin y sus colaboradores empezaron a trabajar en un tipo de
cromatografa donde la fase estacionaria era papel de filtro. El
procedimiento dio resultados reproducibles a comienzos de 1940.
Posteriormente
Izmaylov
AUTOR:
FERNANDO TAPIA
PANIAGUA y Shrayner distribuyeron el material de
soporte
una placa
de
vidrio.
sistema se
PROHIBIDA
LA sobre
REPRODUCCIN
TOTAL O
PARCIAL
DEL Finalmente
DOCUMENTO SIN este
EL PERMISO
conoci como Cromatografa en Capa Fina (TLC)
DEL(Egon
AUTOR. Stahl,
Cromatografa de gases
Martib y James publicaron en 1952 la elucin de gases de
cidos orgnicos y aminas. Pequeas partculas del material
de soporte fueron recubiertas con un lquido no voltil y
empaquetadas en tubo de vidrio caliente. Las mezclas se
inyectaban a la entrada y eran impulsadas por gas
comprimido.
Golay (1957) concluy que columnas muy largas (90-180 m)
con dimetro estrecho (0,25 mm) producan mejores
separaciones.
Cromatografa lquida de alta resolucin
Giddings predijo en 1954 la aplicacin de los mismos
principios de la CG a la cromatografa lquida (tamaos muy
pequeos de fase estacionaria distribuidos en una fina capa
en las paredes de la columna en paredes de poco dimetro).
Esta tcnica no se desarroll hasta la aparicin de bombas
capaces de establecer un flujo estable a altas presiones.
AUTOR: FERNANDO TAPIA PANIAGUA

PROHIBIDA LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL DEL DOCUMENTO SIN EL PERMISO
DEL AUTOR.
Cromatografa de intercambio inico

Los intercambiadores son sustancias naturales o artificiales
con iones positivos o negativos anclados a la estructura del
intercambiador, lo que permite retener con mayor o menor
fuerza los iones de signo opuesto presentes en la muestra.
Puede ser aplicada a la separacin de iones orgnicos, por
tanto tiene una particular importancia en la separacin de
aminocidos y cidos nuclecos.
Cromatografa de exclusin
En 1959, Flodin y Porath desarrollaron polmeros de celulosa
que actuaban como tamices moleculares para sustancias
dispersas en lquidos. Las molculas grandes no entraban en
los poros del tamiz. Sin embargo, las molculas pequeas
ven interrumpidas su migracin
El trmino genrico para estas separaciones es el de
Cromatografa de Exclusin Molecular

DEL AUTOR.
FASE ESTACIONARIA: material inmvil implicado en el

proceso Cromatogrfico. Las interacciones qumicas cruciales
tienen lugar entre el analito y la fase estacionaria. Puede ser
un slido, un lquido enlazando a un slido (cromatografa de
reparto) o radicales qumicos enlazados a un slido
(cromatografa de adsorcin o intercambio inico)
SOPORTE: material sobre el que se sustenta la fase
estacionaria
FASE MVIL : fluido que arrastra la muestra a travs de la
columna y en ocasiones interviene en el proceso
cromatogrfico. Puede ser un lquido, gas o fluido supercrtico.
RETENCIN: fenmeno que causa la inmovilizacin de las
molculas de analito debido a la atraccin entre stas y el
adsorbente. La retencin ocurre cuando las molculas de
analito tienen ms afinidad por la fase estacionaria que por la
matriz en que se encuentran.
ELUCIN: proceso por el cual un analito se suelta de la fase
estacionaria a la que estaba unido. La elucin ocurre cuando
el analito tiene ms afinidad por la fase mvil que por la fase
estacionaria

DEL AUTOR.
ELUYENTE: fase mvil empleada en el proceso

cromatogrfico. El trmino eluyente se reserva para fases
mviles lquidas o supercrticas (no gaseosas)
ELUIDO : fase mvil que sale de la columna.
Determinadas fracciones del eluido contendrn el analito.
DETECTOR: Aparato que registra una propiedad fsicoqumica del material eluido.
CROMATAGRAMA:
Representacin de una propiedad
fsico-qumica del eluido en funcin del tiempo o volumen
de elucin

DEL AUTOR.
CROMATOGRAFA
Qu es?
En trminos generales es la separacin de los componentes de
una mezcla disuelta en una fase mvil y al ser desplazados
por sta a travs de una fase estacionaria.

DEL AUTOR.
Cmo ocurre?
Los procesos cromatogrficos tienen lugar como resultado de
repetidas adsorciones y desorciones durante el movimiento de
los componentes de la muestra a lo largo del lecho estacionario,
alcanzndose la separacin gracias a las diferencias en los
coeficientes de distribucin de los distintos componentes de la
muestra.
Por tanto, estas separaciones se basan en las distintas
velocidades de migracin que tienen los componentes de la
muestra en la fase mvil utilizada.

DEL AUTOR.
Qu
pasa
dentro
de
la
columna?
1- La cromatografa se basa en
fuerzas competitivas que dos
fases, una fija y otra mvil
establecen por las molculas del
soluto.
2- La tendencia a solubilizar las
molculas de soluto por parte del
solvente, a la larga, habr de
imperar sobre las fuerzas de
retencin del relleno de la
columna, consiguiendo antes o
despus arrastrar ese soluto.
3- Las fuerzas de retencin por
parte de la fase estacionaria y las
de disolucin dependen de las
estructura molecular

DEL AUTOR.
La causa de la diferente movilidad de

los analitos en el sistema es la
diferencia a la tendencia a ser retenido
en la f. estacionaria en relacin a
permanecer en la f. mvil
Una vez separados, los analitos pasan
por un detector, cuya seal es
trasformada en una presentacin de la Cada compuesto abandona la
seal. CROMATOGRAMA
columna en forma de pico
simtrico.
El
cromatograma
contiene
la Cada pico aparece a un
informacin relativa la muestra o del tiempo de retencin
funcionamiento del sistema.
caracterstico
Cuanto mayor sea la
diferencia de tiempos entre
dos picos mas fcil es su
separacin
CadaSIN
pico
es caracterstico
PROHIBIDA LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL DEL DOCUMENTO
EL PERMISO
DEL AUTOR.
Segn la composicin del

Segn las caractersticas del
eluyente
lecho cromatogrfico
Isocrtica
abierto: en papel, en
De gradiente
capa fina
Segn la polaridad de la fase
cerrado: en columna
estacionaria
Segn la presin del eluyente
Fase normal.
Baja presin
Fase inversa
Alta presin
Segn el mecanismo de
Segn el estado fsico de la f.
retencin
movil
De reparto
cromatografa de gases
De filtracin en gel o de
cromatografa de lquidos
exclusin molecular
Segn el estado fsico del lecho
De adsorcin
lquido-lquido
De intercambio inico
slido-lquido
AUTOR:
FERNANDO TAPIA PANIAGUA
De afinidad
10
DEL AUTOR.
Interacciones
analito-fase
estacionaria
Fase
mvil
Disposicin fase
estacionaria
Adsorcin
Lquida
Columna
Isocrtica
Fase normal
Isoterma
Particin/
Reparto
Gaseosa
Placa
Gradiente
Fase inversa
Gradiente
Exclusin
molecular
Fluidos
supercrti
cos
Papel
Intercambio
inico
Afinidad
Quiral
Composicin Polaridad de Temperatura

fase mvil
fase mvil
eluyentes
RETENCIN
FUNDAMENTO.
Adsorcin
Inter. No Covalentes
Particin
Polaridad
Cambio inico
Carga
Exclusin
Tamao molecular
Afinidad
Actividad biolgica
Quiral
Actividad ptica

DEL AUTOR.
11
La cromatografa se clasifica
Fase mvil Gas: C.Gases
Fase mvil Liquido: C. Lquida
A su vez la Cromatografa Lquida:
Sobre un soporte slido: C. Capa Fina
Empaquetada en una columna: C.
Columna

DEL AUTOR.
12
Cromatografa en papel y en
capa fina
Cromatografa de reparto
Coeficientes de reparto a y de
retencin Rf caractersticos para
cada soluto en unas condiciones
dadas
Deteccin: precisa reacciones
especficas de tincin
(ninhidrina en aminocidos, etc)

DEL AUTOR.
13
Cromatografa lquida de baja presin

Elucin por gravedad o por bomba
peristltica
Cromatografa lquida de alta presin
(HPLC)
Elucin por alta presin (hasta 500
atmsferas)
Alta resolucin, rapidez y
reproducibilidad
Purificacin de
molculas biolgicas de gran variedad de
propiedades y tamaos

DEL AUTOR.
14
CROMATOGRAFA EN FASE NORMAL: el lecho estacionario es

de naturaleza fuertemente polar (p. ej. Gel de slice) y la fase
mvil es apolar ( p. ej. n-hexano o tetrahidrofurano). Las
muestras polares quedan retenidas durante tiempos mayores que
las menos polares o apolares.
CROMATOGRAFA EN FASE INVERSA : es exactamente a la
inversa. El lecho estacionario es de naturaleza apolar
(hidrocarburo) , mientras la fase mvil es un liquido polar,
normalmente agua o un alcohol. En este caso cuanto ms apolar
sea la muestra, mayor ser su retencin.

DEL AUTOR.
15
Solutos
LPOFLICOS:
Solventes de baja polaridad.
Los solutos poco polares
eluyen primero
Fase estacionaria: Grupos
polares, ciano, diol, amino o
dimetilamino.
Incrementando la polaridad de
la FM, reducimos el tiempo de
elucin de los analitos.
GRASAS, ACEITES
SOLVENTES ORGNICOS:
HEPTANO, CLOROFORMO,
n-HEXANO
Eluyente: poco polar

DEL AUTOR.
16
Solutos
La ms utilizada en la
actualidad
Solventes de alta-media
La mayora de sustancias
polaridad.
Biomdicas y principios
Los solutos ms polares eluyen
activos
primero
Fase estacionaria: cadenas
alqulicas n-octil o n- octidecil
(C8-C18)
Los grupos se posicionan de
SOLVENTES POLARES:
forma perpendicular a la
AGUA, ACETONITRILO,
superficie generando una
METANOL
estructura de cepillo o brocha
Cuanto mayor es el nmero de
Eluyente: ms polar que
tomos de carbono de la
la fase estacionaria
cadena, mayor es la eficiencia.
Limitaciones respecto al
pH( mayores de 7.5 hidrolizan el17
DEL AUTOR.
soporte, siloxano)
Adsorcin: interacciones electrostticas no inicas (dipolos,

puentes de hidrgeno).
Reparto: La fase estacionaria es un lquido retenido en los poros
de una matriz slida inerte. Se subdividen en cromatografas en
fase normal e inversa (reversa)
Intercambio inico: la fase estacionaria es una matriz slida
inerte que tiene grupos cargados negativa o positivamente y
unidos covalentemente. Los analitos con carga de signo opuesto
al de la matriz quedarn retenidos en ella, separndose del resto
de los analitos con carga del mismo signo que la matriz o neutros
Exclusin molecular: la fase estacionaria contiene partculas
porosas con tamao de poro comparable al tamao de las
molculas que se quieren separar. La separacin se consigue
porque los analitos han de recorrer caminos diferentes (ms o
menos largos, dependiendo del PM) para alcanzar el final de la
columna
Afinidad: Las interacciones que se dan entre fase estacionaria y
analitos son especficas entre pares de molculas (ej. Ag-Ac).
Pese a ser muy eficaz no suele ser posible obtener fases
estacionarias comerciales
Quiral:
Las retenciones del analito en la fase estacionaria, estn
sujetas a la forma isomrica del analito.
DEL AUTOR.
18
Clasificacin general
Cromatografa de
lquidos (LC)
(fase mvil: lquida)
Cromatografa de gases
(GC)
(fase mvil: gas)
Mtodo especfico
Fase estacionaria
Tipo de equilibrio
Lquido-lquido, o
reparto
Lquido adsorbido
sobre un slido
Distribucin entre
lquidos inmiscibles
Lquido-slido, o
adsorcin
Slido
Adsorcin
Resina de
intercambio inico
Intercambio inico
Intercambio inico
Exclusin por tamao
Lquido en los
intersticios de un
slido polimrico
Distribucin/exclusin
Gas-lquido
Lquido adsorbido
sobre un slido
Distribucin entre un
gas y un lquido
Gas-fase unida
qumicamente
Especies orgnicas
enlazadas a una
superficie
Distribucin entre el
lquido y la superficie
enlazada
Gas-slido
Slido
Adsorcin
Especies orgnicas
enlazadas a una
superficie slida
Distribucin entre el
fluido supercrtico y la
superficie enlazada
Cromatografa de fluidos
supercrticos (SFC)
(fase mvil: fluido
supercrtico)

DEL AUTOR.
19
Interacciones reversibles especficas

entre soluto y fase estacionaria
Las fuerzas fase estacionaria-soluto
son
de
adsorcin.
La
fase
estacionaria es un relleno de
adsorbente slido en la columna y la
separacin se basa en repetidas
etapas de adsorcin-desorcin . Est
en desusos y se emplean eluyentes
no polares
La
adsorcin
de
los
analitos
presentes en una disolucin puede
considerarse como el resultado de
una competicin entre el disolvente y
las molculas de soluto por los sitios
de unin (debido a interacciones
qumicas o ms frecuentemente a
interacciones
fsicas)
de
una
superficie adsorbente.
Materiales adsorbentes: xidos de
aluminio, silicatos, carbn activo,
polisacridos, ...
DEL AUTOR.
20
La fase estacionaria ser un lquido

soportado sobre las partculas slidas
de relleno inmiscible con el lquido de
la fase estacionaria. Hay un reparto o
distribucin de los solutos entre los
dos lquidos inmiscibles.
Surgen dos tipos distintos:
Cromatografa
de
particin
lquido-lquido; cuando el lquido
estacionario queda retenido por
interaccin fsico-qumica a las
partculas del relleno.
Cromatografa de fase ligada;
cuando el lquido estacionario est
enlazado qumicamente a las
partculas del relleno.
Segn la relacin de polaridad de las
fases, tenemos:
Fase Normal
Fase Inversa
AUTOR: LA
FERNANDO
TAPIA PANIAGUA
PROHIBIDA
REPRODUCCIN
TOTAL O PARCIAL DEL DOCUMENTO SIN EL PERMISO
DEL AUTOR.
21
El lecho estacionario tiene una

superficie
cargada
inicamente,
con
carga
contraria a la de la muestra.
Esta tcnica se usa casi
exclusivamente con muestras
inicas o ionizables.
Cuanto mayor sea la carga de la
muestra, ms fuertemente ser
atrada hacia la superficie
inica y, por tanto, ms tardar
en ser eluida. La fase mvil es
un tampn acuoso, en el que el
pH y la polaridad se utilizan
Cromatografa
de intercambio
para controlar
el tiempoinico
de
elucin.negativamente --- intercambio
Gel cargado
catinico
Gel cargado positivamente --- intercambio
aninico
DEL AUTOR.
22
Se
rellena
la
columna
(normalmente de slice) con un
material que posea poros de
dimensiones
comprendidas
entre ciertos lmites, con lo que
la muestra es retenida o filtrada
segn
sea
su
tamao
molecular.
Los poros son suficientemente
pequeos para excluir las
molculas grandes de soluto,
pero no las pequeas que
requieren ms tiempo para
pasar a travs de la columna.
Se
utiliza
para
separar
compuestos
de
alto
peso
molecular
(protenas
y
polmeros,
azcares,
cidos
grasos, ..)

DEL AUTOR.
23
Se trata de un tipo especial de

cromatografa de adsorcin slidolquido en la que la sustancia de
naturaleza bioqumica (anticuerpos,
cofactores,
inhibidores
enzimticos)
denominadas
ligandos de afinidad y enlazados
qumicamente en soportes slidos
adecuados, retienen a los solutos
(analitos), tambin de naturaleza
bioqumica, de manera reversible y
selectiva. Las separaciones se
basan en el acoplamiento llavecerradura tpico de la biologa
molecular

DEL AUTOR.
24
La interaccin diferente entre los diasteremeros y el relleno de la

columna es la base de la cromatografa quiral. Un diasteremero
interactuar ms con el relleno de la columna, mientras que el otro
diasteremero, que interacta menos, puede pasar a travs de la
columna y salir de la columna primero.
Los enantimeros del analito forman complejos diastereomricos
con la sustancia quiral del relleno de la columna. Uno de los
enantimeros se enlaza con ms fuerza que el otro, por lo que se
mueve ms lentamente a travs de la columna.

DEL AUTOR.
25
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Eleccin de la tcnica cromatogrfica: informacin acerca de la muestra.

Si contiene una fraccin voltil, la GC nos dar informacin relevante acerca
de esa fraccin.
La fraccin no voltil, con la LC.
Dentro de la LC, a tener en cuenta el peso molecular; donde los mayores
tamaos pasarn por cromatografas de exclusin.
Para pesos moleculares menores, a tener en cuenta la solubilidad del
mismo en disolventes polares. En disolventes no polares utilizaremos las
tcnicas cromatogrficas en fase normal (fases mviles con disolventes de
baja polaridad, inferiores a las de la fase estacionaria).
Si se disuelve en disolventes polares, a tener en cuenta si se trata de
compuestos inicos o no. En caso negativo, la tcnica ser cromatografas
en fase inversa (fase mvil ms polar que la estacionaria).
Si son compuestos inicos, a elegir entre potenciar este carcter para su
separacin (cromatografa de intercambio inico), o inhibir la ionizacin para
utilizar tcnicas de fase invertida.
DEL AUTOR.
26
Cromatografa
Gas-slido
CG
Gases
permanentes
Cromatografa
Gas-lquido
Muestra
volatil
Cromatografa
en fase
invertida
Inhibir la
ionizacin
Cromatografa
Lquida
PM
> 3000
Solutos
inicos
Electrolitos
dbiles
Forzar la
ionizacin
Soluble
Disolventes
polares
si
no
Cromatografa
inica
Cromatografa
Cromatografa
en fase
Exclusin
normal
Por tamao
DEL AUTOR.
27
CROMATOGRAFO LQUIDO
Bomba
Eluyente
Inyecto
r
Columna
Detecto
r
CROMATOGRAFO DE GASES
Inyecto
r
Controla
dor de
flujo
Gas
carrier
Detecto
r
Column
a
Horno

DEL AUTOR.
28

DEL AUTOR.
29
CROMATOGRAFO LQUIDO
Bomba
Recipro
ca
Inyecto
r
Columna
Detector/
es
Eluyente/
es

DEL AUTOR.
30
Solventes de alta Pureza. Calidad HPLC

Velocidades de flujo moderadas para un
tiempo de anlisis razonable.
Necesario Filtracin de Muestras
La FM se obliga a pasar a travs de la
columna, instrumento ms elaborado que en
CG
Composicin constante de la Fase Mvil:
Elucin Isocrtica
Composicin programada de la Fase Mvil:
Elucin en Gradiente
SISTEMAS PARA EL
TRATAMIENTO DE
DISOLVENTES
Sistemas de Filtracin
Desgasificadores
Mezcladores
CONDICIONES DE UN ELUYENTE
Disponible comercialmente y Bajo
precio
Alta Pureza y Estabilidad
Disuelva la muestra y patrones
Miscible con otros disolventes
No degradar o disolver la F. E.
Tener baja viscosidad (cadas presin)
Filtrable y Desgasificable.
Compatible con el Detector.

DEL AUTOR.
31
Elucin Isocrtica:
La FM se mantiene constante
durante todo el anlisis
(composicin y componentes)
La composicin de la FM
(polaridad) afecta a la
resolucin segn estemos en
F.Normal o en F. Inversa
F. Normal:
aumentamos la 32
PROHIBIDA LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL DEL DOCUMENTO
SIN Si
EL PERMISO
polaridad de
FM, disminuimos
DELla
AUTOR.
Elucin en Gradiente: La
composicin y/o los
componentes de la F.M varan
en el tiempo.
til, para resolver los picos de
forma adecuada, pero en
tiempos relativamente
razonables.

DEL fases.
AUTOR.
Cambio de
33
Debe
poder generar presiones

por encima de los 6000 psi
Libre
de pulsaciones
Caudales
de Flujo entre los 0.1

ml y los 10 ml
Ha
de tener una gran

reproducibilidad.
Resistente
a la corrosin
Tipos
Bombas
reciprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas.
DEL AUTOR.
34
Formada por cmaras donde el

solvente se bombea en
movimiento de vaivn
Consta de vlvulas que se abren
y se cierran alternativamente
controlando el flujo
Obtiene presiones de hasta
10000 psi

DEL AUTOR.
35
TIPOS DE
INYECTORES
Manuales
Automticos
Pueden presentar o no
bucle de carga
( generalmente en los
Automticos).

DEL AUTOR.
36
PRECOLUNAS
Colocadas antes de la columna
para eliminar materias en
suspensin y contaminates del
disovente
Composicin semejante al
relleno de la columna.
COLUMNAS
Exterior de acero inoxidable
100-300 mm de longitud
4 10 mm de dimetro interno
1 10 m de tamao de
partcula
40.000 60.000 platos

tericos/metro

DEL AUTOR.
37
RELLENOS COLUMNA Y
PRECOLUMNAS
-Pelicular
Bolas de vidrio o polmero, no porosas y
esfricas
Sobre su superficie se deposita una capa
delgada de slice, almina o una resina de
intercambio inico
Se utilizan ampliamente en precolumnas
-Partcula porosa
Formado por Micro partculas de slice
DEL AUTOR.
38
SELECCIN DE UNA COLUMNA HPLC

http://www.chem.agilent.com/Library/selectionguide/Public/599
0-4435ES_low.pdf
http://www.analitica.cl/PDF/INSUMOS/Columnas%20HPLC.pdf

DEL AUTOR.
39
ndice refraccin
Absorbancia UV/Vis
Fluorescencia
Electroqumicos
Masas
Fluorescenc
Masas
ia
Selectiv
Selectiv
Respuesta Universal
Selectivo
o
o
Sensibliidad
4 g
5 ng
3 pg
1 pg
lienalidad
10
10
10
10
Sensible al
Si
No
No
Si
flujo
RI
UV/VIS
Sensible a la
temperatura
Si
No
No
No

DEL AUTOR.
40
DETECTOR DE ABSORBANCIA
Cubeta de flujo en forma de Z
Para minimizar el ensanchamiento
de banda extra columna, el volumen
de las cubetas debe ser lo menor
posible (1-10 m)
Detectores uv-vis
Detectores de diodos

DEL AUTOR.
41
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia se detecta por medio de un
detector fotoelctrico colocado
perpendicularmente respecto al haz de excitacin.
Hay que indicar la longitud de onda de Excitacin
y la Longitud de onda de Emisin.
Son muy similares a los detectores de
Absorbancia (solo trabaja con una longitud de
onda).
Son altamente sensitivos.
A menudo es necesario la utilizacin de
Reacciones de Derivatizacin.
Sistemas de Derivatizacin ( Post y Pre
columna)
DEL AUTOR.
42
DETECTOR IND. REFRACCIN

El disolvente pasa a travs de la
mitad de una cubeta y el
eluyente de la columna por la
otra mitad
Los dos compartimentos estn
separados por una placa de
vidrio montada a un ngulo tal
que si las dos disoluciones
difieren en el ndice de refraccin
se produce una desviacin del
haz de luz
Responde a casi todos los
solutos.
Poco sensitivos.
Muy sensible a la temperatura y
cambios
enLAelREPRODUCCIN
eluyente. TOTAL O PARCIAL DEL DOCUMENTO SIN EL PERMISO
PROHIBIDA
DEL AUTOR.
43

DEL AUTOR.
44
La muestra tras la separacin

cromatogrfica:
Sistema de generacin de Iones
Sistema de seleccin de Iones
Detector de Iones

DEL AUTOR.
45
APLICACIONES HPLC
Bioqumica
Clnica
Agroqumica
Petrleo
Farmacutica
Industria
M.A
Alimentaria
Forense
Polmeros
aa
Anticolvunsionantes
Pesticidas
Aceites
Antibiticos
Alcoholes
Contantes
Micotoxinas
Alcaloides
Antioxidantes
Sales
biliares
Teofilina
Herbicidas
Lubricantes
Anticonceptivos
Aminas
Poblacin
acutica
Aromas
Toxinas
Aceleradores
AG
Barbitricos
Fertilizantes
Productos
sintticos
Cosmticos
Aromticos
Trat.
Residuos
Azcares
Tintes
Glcidos
Hormonas sexuales
Hormonas
vegetales
Medicamentos
Isocianatos
Plaguicidas
Nitrosaminas
Plastificantes
Hormonas
Antidepresivos
tricclicos
Hormonas de
insectos
Hormonas
Iones
metlicos
Conservantes
Surfactantes
Nucletidos
Fenoles
Vitaminas
Pinturas
Ismeros
pticos
Detergentes
Porfirinas
Pptidos
Pp
PG
Purinas
Pirimidinas
Esteroides
Resinas
Estudio de 160 plaguicidas: CG/MS

DEL AUTOR.
HPA por HPLC/Fluorescencia

DEL AUTOR.
Los parmetros que definen el comportamiento de un soluto y

que sirven para los clculos son:
Tiempo de retencin y factor de capacidad
Eficiencia
Selectividad
Resolucin
Coeficiente de Distribucin (P)
Determina la constante con la que se representa el
equilibrio de un soluto entre la dos fases
Variables
Composicin fase mvil y estacionaria
Temperatura
Presin de columna
Concentracion en fase estacionaria

Concentracion en fase movil

DEL AUTOR.
49
Tiempo de retencin
Tiempo que tarda en recorrer el sistema un
grupo de molculas de un mismo compuesto.
Se expresa en minutos,
Tiempo muerto.
Tiempo entre la inyeccin y la salida y de una
sustancia que no interacciona con la fase
estacionaria.
Tiempo de retencin corregido:
Tiempo de retencin tiempo muerto
Factor de capacidad
Cociente entre el tiempo que permanece el
compuesto en la fase estacionaria dividido el
tiempo que permanece el compuesto en la fase
mvil.
Es una medida de la retencin de los
compuestos y es funcin de la qumica de la
columna, y de la polaridad de la fase mvil.
Cuanto mayor sea este factor ms retenido
estar el soluto en fase estacionaria.
k'
tr ' (tr tm)
tm
tm

DEL AUTOR.
50
Eficacia.
Capacidad de obtener picos estrechos. A mayor eficacia menor
ensanchamiento de la banda. Se expresa como Nmero de Platos
tericos.
Nmero de platos tericos (N)
Un plato terico es una seccin imaginaria de la columna donde
2
se alcanza el equilibrio entre la fase estacionaria
y la fase mvil
tr
N
5,54 (plato).
antes de pasar a la siguiente
seccin
A mayor valor de N,
w
1/ 2
mayor eficacia de la columna. Interesa

tener un nmero elevado
de platos tericos de poca altura para que la eficacia de la
columna sea mayor.
tr= Tiempo de retencin
FERNANDO
w1/2=AUTOR:
Anchura
deTAPIA
picoPANIAGUA
a la mitad de la altura del mismo

DEL AUTOR.
51
Selectividad
K 2'
Mide la separacin entre dos compuestos,
y se expresa
mediante la retencin relativa. '
K1
Cuando ms parecidos sean k2 y k1 menos separados estn

los picos. Se considera una selectividad aceptable aquella con
valores superiores a 1,14
Este factor va a depender de:
Naturaleza de las fases
Naturaleza de los solutos
Temperatura
No depende de las caractersticas cromatogrficas del sistema.
DEL AUTOR.
52
Resolucin (Rs )
1 1 K 1
N
2 t
4
K
R
Selectividad-Retencin-Eficacia
wb1 wb 2
Medida cuantitativa de el grado de separacin o resolucin de
dos bandas adyacentes se define como la distancia entre los
picos de las bandas dividida entre el ancho promedio de las
bandas.
Valores de R = 1,5 dan lugar a separacin de picos cercanos
hasta la lnea de base, considerndose una resolucin total.
Valores R mayor o igual a 1 representan una buena resolucin y
menores de 0,8 son insuficientes.
La resolucin depende de:
R
Eficacia. N platos tericos. Relacin

Retencin. Factor de capacidad
Selectividad. A de ser superior a 1.
DEL AUTOR.
53
Factor de asimetra (As)

mide la simetra de los picos, cuando el pico es
asimtrico indica que el soluto est saliendo
imperfectamente. BCA
0,9 < As < 1,02

DEL AUTOR.
54

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