BIOLOGIA MOLECULAR

Tecnologia
do DNA recombinante

Contedo
1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrio
3. Vetores de clonagem
- Plasmdios
- Bacterifagos
- Cosmdeos
4. Etapas de clonagem molecular
5. Aplicaes

HISTRICO
Watson & Crick
Estrutura do
qumica do DNA
(1953)

Nature, 25 - Abr - 1953

Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)

Ian Wilmut
clonagem de mamfero
(1997)

HISTRICO
PGH
Conhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)

Transgenia
(1995...)

Prtica clnica
Testes genticos
(1995...)

O que um DNA recombinante?

- uma molcula de DNA formada
pela ligao de duas molculas de
origens diferentes (Ex. DNA de
planta ligado a um plasmdio)

A engenharia gentica atua no nvel

molecular, onde as diferenas entre
espcies desaparecem

ENZIMAS DE RESTRIO

ENZIMAS DE RESTRIO
Descritas em
1970,

W. Alber

H. Smith D. Nathans

Uma enzima de restrio ou endonuclease de restrio

um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre
que identificar uma seqncia particular de nucleotdios
que seja o stio de restrio da enzima;

ENZIMAS DE RESTRIO
Funo Natural: proteger o
DNA bacteriano do DNA
exgeno

ENZIMAS DE RESTRIO
A enzima BamHI reconhece a seqncia dupla fita:

BamHI

- reconhecem seqncias especficas de nucleotdeos no

DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

ENZIMAS DE RESTRIO
Nomenclatura
BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5 G/GATCC 3
EcoRI - Escherichia coli R
5 G/AATTC 3
HaeIII - Haemophilus aegyptius
5 GG/CC 3
PstI - Providencia stuartii
5 CTGCA/G 3

ENZIMAS DE RESTRIO

EcoRI

370 C, 1 hora,
com tampo
adequado

ENZIMAS DE RESTRIO
Tipos de cortes:

- Produo de terminais coesivos (adesivos, protuberan

- Produo de terminais abruptos (ou cegos)

ENZIMAS DE RESTRIO

181

NarI
~~~~~~
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC
TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG

241

ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT

TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA

301

TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT

ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA

361

421

HindIII
PstI
~~~~~~~
~~~~~~
TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG
AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC
XbaI BamHI
KpnI
EcoRI
~~~~~~~~~~~~~
~~~~~~~
~~~~~~~
ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT
TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA

TIPOS DE VETORES

TIPOS DE VETORES

Vetores

Plasmdeos
Cosmdeos

Bacterifagos

Hospedeiro
s
Bactrias / leveduras

Utiliza
o
clonagem

VETORES PLASMIDIAIS

Plasmdios so molculas de DNA circular, fita dupla,

extracromossomais, que ocorrem naturalmente em
bactrias e algumas leveduras
pUC18
pBR322
pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de at 9 kb

VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expresso
em Procarioto

rCanamicina

oriE
HindIII
XbaI

pUS974
4039 pb

RBS

hsp60
oriM
MT19

VETORES PLASMIDIAIS
Promotor CMV

rAmpicilina

Intron
Eco RI (1251)

pTarget
5670 bp

Bam HI (1257)
Eco RI (1319)
Hin dIII (1326)

Poly A

rNeomicina

Vetor de Expresso
em Eucariotos

Vacina Vetorizada (rBCG)

rCanamicina

rCanamicina

oriE
oriE

HindIII
XbaI

pUS973
3984 bp

HindIII
XbaI

pUS974
4039 pb

RBS

RBS

hsp60
Promotor hsp60

oriM

oriM
MT19

rCanamicina
Kan(R)
oriC

oriE

pUS977
3984 bp

HindIII
XbaI
RBS

pUS2000
HindIII

3759pb

XbaI

oriM

Promotor pAN

p18kDa
OriM

VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expresso
em Eucariotos

BACTERIFAGO

Vrus que infectam bactrias;

- Utilizados para clonar fragmentos de

9kb a 25 kb

BACTERIFAGO
Ciclo Ltico

Ciclo
Lisognico

COSMDEOS
- So hbridos
bacterifagos;

entre

plasmdios

- Utilizados para clonar fragmentos de 25

a 35 kb;

VETORES DE CLONAGEM

Caractersticas essenciais
Replicao autnoma
Marcador de seleo (antibitico)
Stio nico de clonagem

VETORES DE EXPRESSO

Necessitam de um promotor forte,

de um RBS e de ATG
Promotores induzveis
Sinais de secreo
Fuso com protenas carreadoras

CLONAGEM MOLECULAR

CLONAGEM MOLECULAR

o isolamento e a
propagao em um
organismo
de
molculas idnticas de
DNA

CONSTRUO DE UM
MICRORGANISMO RECOMBINANTE
1. Obteno do DNA a ser clonado
2. Preparao do vetor
3. Ligao do vetor com o inserto
4. Transformao da bactria
5. Seleo dos clones recombinantes

1.Obteno do DNA a ser

clonado
-

Extrao de DNA;
PCR
Digesto
Purificao

1.Obteno do DNA a ser

clonado
PCR

94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C

35
ciclos

Eletroforese em gel de agarose

Visualizao do DNA em luz

ultravioleta

3.Preparao do vetor
Digesto
Purificao

Plasmdeo
Circular

Plasmdeo linear

Digesto
com
Enzimas de
restrio

4. Ligao
Extremidades coesivas

Fragmento
de DNA inserto

LIGASE

DNA
plasmidial vetor

CHOQUE TRMICO

5.Transformao da bactria

ELETROPORAO

5.Transformao da bactria

ELETROPORAO

5.Transformao da bactria

6.Seleo dos clones recombinant

Construo do DNA Recombinante

Molcula de DNA de
um plasmdeo circular

Molcula de DNA de um plasmdeo

linear com extremidades coesivas

anelamento

Clivagem com
enzima de
restrio

Ligao covalente
pela DNA ligase
Insero em
uma clula
hospedeira

Molcula de DNA
plasmidial contendo
o inserto

Extrao de DNA de L. interrogans

Leptospira interrogans

meio EMJH

Extrao de DNA

PCR
94C 5 min
94C 1 min
50C 1 min
72C 1 min
72C 7 min

Primer F

Primer R

30 ciclos
lipL32
768 pb

Construo dos Vetores

PCR

Clonagem em
Vetores de
expresso
Transformao E. coli

Seleo dos Clones

recombinantes

lipL32
768 pb

Triagem

Digesto

Extrao

768 pb

Expresso de Protenas Recombinantes

Promotor T7

Xba I (59)

6X His
Bam HI (137)
Hin dIII (178)

Transformao da
E. coli

oriE
f1 ori

pAE
2831 bp

rAmpicilina

Cultura de
Clulas

Purificao
da Protena

Purificao de protenas recombinantes

Ligao
Transformao por
Eletroporao

pT7
Xba

I (59)
6x His

pUC ori

Xho

I (131)
Bam

H I (468)

Extrao de DNA
plasmidial

LipL32

pAE/LipL32

3547 bp

Eco

R I (887)

Hin

d III (894)

E. Coli DH5
AmpR

f1 ori

pLysS
Transformao por Choque
Trmico
E. coli (BL21)

codon pluss
SI
DE3
Cepas de E. coli para
expresso de protenas

SDS-PAGE (Eletroforese de protenas)

SDS-PAGE

Expresso de Protenas Recombinantes

Expresso em diferentes cepas de E.coli

Purificao de Protenas
Recombinantes
Akta Prime

Gel de poliacrilamida 15%.

30kDa
1.

BENCHMARKTM Protein Ladder em

kDa

2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluies).

APLICAES

VACINAS RECOMBINANTES
PRIMER F

1. PCR

Xba

Primer R
I (4)

Bam

LipL32 0906

HI (342)

Hin dIII (761)

lipL32
768 bp

L. interrogans

lipL32

2. Clonagens
pAE

3.
Multiplicao

pTARGET

E.coli (BL21)

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

pUS973
pUS974
pUS977

Vetor
Plasmidial

E.coli TOP10

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

E.coli TOP10

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

4. Vacinao
Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Pl asmid
ial
Vetor
Plasmid
ial

Protena Recombinante

Vacina de DNA

Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmid
ial

Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Pl asmid
ial

Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Pl asmid
ial
Vetor
Plasmid
ial

BCGr

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

Vetor
Plasmidial

ANIMAIS TRANSGNICOS

PLANTAS TRANSGNICAS