Cromatografa Lquida de

Alta Resolucin

Que es HPLC
HPLC son la siglas en ingles para High
Performance Liquid Chromatography.
Esencialmente HPLC es una tcnica de separacin
de mezcla que utiliza equipo de alta presicin y
tecnologa

Aspectos Histricos
H C3

CH

CH 2

CH

Mg

N
CH

M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906)

1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)

Carbonato de Calcio, Eter de etroleo.

0
0

1940's Cromatografa de Particin y Papel.

1950's Cromatografa de Gases, Capa Fina, Filtracin

en Gel y Elusin por gradiente.

1960's Introduccin Comercial de Equipos HPLC

CH

CH

CH

CH

Componentes de un equipo de HPLC

Inyector

Mezclador

Pumps
Chromatograma
Columna

Detector

Solvents

Reservorios: recipientes utilizados para mantener la fase

movil disponible para ser impulsada por la bomba hacia el
inyector y luego hacia los otros componentes del sistema.
Bomba: dispositivo de gran precisin para impulsar solvente a
velicidades de flujo exactos y libre de pulso. La bombas pueden ser:
- Isocrticas: Solo tienen capacidad de impulsar solvente o fase mvil
premezclado y desgasificado.
- Cuaternarias: tienen capacidad para mezclar hasta cuatro solventes
y hace gradiente.
- Binarias: Tienen capacidad para mezclar dos solventes e impulsar la
mezcla de solvente a flujos muy bajos. En la actualidad se utilizan
para acoplarse con detectores de masas.

Inyectores
Los inyectores son los dispositivos esenciales para
colocar la muestra dentro del sistema. Pueden ser:

Manuales: en estos dispositivos la muestra se

inyecta con una jeringa a un loop de volumen fijo y
se acta manualmente.
Automticos: La operacin de estos es
desatendida por el operadores y permiten mejor
manipulacin de la muestra.

Detectores
Los detectores son dispositivos que monitorean el flujo de
solvente que sale de la columna: Pueden ser:
- De luz ultravioleta y visible (UV/Vis) los cuales a su vez pueden
ser de longitud de onda variable o de arreglo de diodos.
- De fluorescencia
- ndice de refraccin
- Electroqumicos
- De masas

Proceso de Separacin,
Columnas

Fase estacionaria

Fase mvil

Empaquetado tpico de las

columnas de Cromatografa Lquida
OH

OH

OH
O

Si

Si
Si

Si
O

OH
Si

Silica Gel
Surface
Chemically Modified
Silica Gel

Pores

CH

Si
Si

Si - O - Si - (CH2 )17 CH 3
CH

Si

Si

Si

Soporte tpico de las columnasEstireno DVB

CH = CH 2

CH = CH 2

- CH 2- CH - CH2- CH - CH2 - CH - CH2 -

CH = CH 2

- CH 2- CH - CH2- CH - CH2 - CH - CH2 -

Styrene

Divinyl Benzene

Soporte para:
Fase reversa y fase normal
Intercambio Inico
Cromatografa de Exclusin
por Tamao
10

Modos de la Cromatografa
Lquida
Tipos de Compuestos
Separados

Modo

Fase estacionaria

Fase mvil

Neutros
cido dbiles
Bases dbiles

Fase reversa

C-18, C-8, C-4, C-2

agua/Organico Modific

cidos, inicos, bases

Ion-Par

C-18, C-8

agua/Orgnico
Reactivo Ion-Par

Compuestos Insolubles en
agua, isomeros orgnicos

Fase Normal

Silica, Amino, Ciano

Diol

Orgnicos

Inicos, iones Inorgnicos

Intercambio Inico

Resina de intercambio Aqueous/Buffer

Compuestos de alto PM
Polmeros

Exclusin por tamao Poli estireno- Silica

Inico o cationica

Counter Ion

Filtracin Gel Acuosa

Permeacion GelOrgnica

11

Diferencias entre Cromatografa

Lquida y Cromatografa de Gases

Solamente un 20% de los

compuestos orgnicos
conocidos pueden ser
analizados por
Cromatografa de Gases.

Polarity

LC

GC
LC
GC

10

10

10

10

10

Solute Molecular Weight

12

Parmetros Cromatogrficos
t

R(B)

t R(A)

= Tiempo de Retencin
R
t = Tiempo de elusin de un compuesto no retenido
0
W = ancho de pico a la base
t

0
A

Inject

Detector Response

Time

13

Parmetros de Separacin

Seleccin de la Fase Estacionaria

Dimetro y Largo de la Columna
Composicin de la Fase Movil
Temperatura
Flujo
Tamao de la Muestra

14

Revisin:
1. Mencione tres diferencias entre
Cromatografa de Gases y Cromatografa
Lquida.
2. Cual es el modo mas ampliamente usado en
Cromatografa Lquida?
3. Cual es el modo mas utilizado para la
separacin de iones en solucin?
15

Revisin:
4. Mencione las partes de un instrumento de
Cromatografa Lquida.
5. Cual es el smbolo para un componente
no retenido durante la elusin?
6. Cual es la diferencia entre fase normal y
fase reversa?
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