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Curso de Aplicaciones clnicas de la Citometria de Flujo

Ao 2013
Bioq. Viviana Novoa

Los Sindromes Mielodisplsicos son un grupo de


enfermedades
clonales
de
la
Stem
Cells
hematopoytica
caracterizada
por
citopenia(s),
displasia de una o ms lneas celulares mieloides,
hematopoyesis inefectiva y aumentado riesgo de
desarrollar leucemia mieloide aguda.
Presencia de alteraciones morfolgicas, acumulacin de
anomalas genticas y diversas alteraciones fenotpicas
en precursores y clulas maduras en M.O.

Incidencia en E.E.U.U: 3.4 casos /100.000 habitantes. Otros


pases han reportado datos similares.

Su incidencia aumenta con la edad. Ms frecuente entre los 65-

70 aos. En 70 aos: 15-50 casos/100.000 habitantes.


Es ms frecuente en hombre que en mujeres.

Poco frecuente en nios y adolescentes. Representa 5% de los

tumores hematopoyticos en pacientes menores de 14 aos.

El pronstico y el curso de la enfermedad vara entre pacientes.


Existen SMD primarios y secundarios.

Agentes alquilantes: mostazas nitrogenadas, nitrosureas,

clorambucilo, ciclofosfamida, cisplatino y carboplatino.

Agentes que inhiben la DNA topoisomerasa II: etopsidos y

antacclicos.

Radioterapia: irradiacin corporal total o hemicuerpo

y derivados
delqumicos,
petrleo.pesticidas, fertilizantes,
benceno
Exposicin
a solventes,

FAB (1976): 2 categoras ( AREB y LMMC)


FAB (1982): basada en criterios morfolgicos (% de blastos en SP y

MO, n abs. de monocitos, bastones de Auer y cant. sideroblastos


en anillo). 5 categoras (AR, ARSA, AREB, AREB-t, LMMC)

OMS/WHO (1999 y 2001): introduce cambios para separar algunas

entidades. Disminuye el % de blastos a 20% y reclasifica la LMMC a


MDS/MPD. 10 categorias ( por ej: se divide AREB en AREB1 y
AREB2, se agrega MDS con del(5q) y se elimina AREB-t)

OMS/WHO (2008): clasifica los SMD y los SMP. 11 categoras.

Citopenia refractaria con displasia unilinaje (RCUD)

Anemia refractaria (AR)


Neutropenia refractaria (NR)
Trombocitopenia refractaria (TR)

Anemia refractaria con sideroblastos en anillo (ARSA)


Citopenia refractaria con displasia multilinaje (CRDM)
Anemia refractaria con exceso de blastos tipo 1 (AREB-1)
Anemia refractaria con exceso de blastos tipo 2 (AREB-2)
SMD asociado con delecin aislada a del (5q)
SMD no clasificable (MDS-U)

Prerrequisitos o criterios escenciales:

Citopenia constante en uno o ms de los siguientes linajes: Hg11g/dl; neutrfilos


1,5x109/l; plaquetas100x109/l.
Exclusin de otras causas hematopoyticaso no hematopoyticas de desrdenes
primarios para citopenias o displasia.

Criterios decisivos o relacionado:

Displasia de al menos 10% de todas las clulas en uno o ms linajes en MO: mieloide,
eritroide, megacarioctico o ms de 15% de sideroblastos en anillo.
5-19% de blastos en MO.
Anomalas cromosmicas tpicas por citogentica convencional o por FISH.

Co-criterios (para pacientes que cumplen criterios escenciales pero


no criterios decisivos pero presentan caractersticas clnicas tpicas
de SMD):

Fenotipo anormal de clulas (eritroides o mieloides) de MO claramente indicadores


de poblacin monoclonal por Citometra de Flujo.
Signos moleculares evidentes de poblacin monoclonal:Humara, Mutaciones
puntuales (ej:RAS)

La Citometra de flujo (CF) permite realizar una


evaluacin cuali-cuantitativa de las diferentes
poblaciones celulares de la MO en las serie
mielomonoctica y eritroide, como as tambin en los
progenitores hematopoyticos
CD34+, detectando
cambios fenotpicos en los patrones de maduracin y
diferenciacin, pudiendo as definir la existencia de un
desorden mieloide clonal

Evaluacin cuantitativa y cualitativa de:


Precursores CD34+
Serie granulocitica neutrfilo
Serie monoctica
Serie eritroide
Evaluacin CUANTITATIVA de blastos CD34(+) o CD117(+)CD34(-),

hematogonias B CD34(+) y celulas monociticas inmaduras.


Evaluacin

CUALITATIVA de alteraciones en los patrones de


maduracin de las distintas series y patrones inmunofenotpicos de los
precursores CD34(+).
NO existen marcadores ni patrones aberrantes ESPECIFICOS de SMD
La citometra distingue entre MO react. / normal vs. neoplasia mieloide

2007. Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the

myelodysplastic syndromes: Consensus statements and report from a working


conference.
2008. Flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from a working
conference.
2009. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes:
report from the first European LeukemiaNet working conference on flow
cytometric in myelodysplastic syndromes.
2009. Diagnostic utility of flow cytometric in low-grade myelodysplastic
syndrome: a prospective validation study.
2012. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of
myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch
Working Party on flow cytometry in MDS.
2012. Update on developmentets in the diagnosis and prognostic evaluation of
patients with myelodysplastic syndromes (MDS): consensus statements and
report from an expert workshop.
2012. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: a
report from an international consortium and the European LeukemiaNet
working group.
2009 y 2010. Primer y Segundo Consenso del Grupo Rioplatense de

Citometra de Flujo.

Estandarizar el estudio de esta patologa para poder llegar a

resultados homogneos

Unificar criterios preanalticos y procesamiento de la muestra.

Definir paneles de marcacin mnimos y mtodos de anlisis.


Establecer modelos de informes de resultados.

Educacin y capacitacin continua.

Muestra vlida: Aspirado de mdula sea en fresco sin fijador.

24 hs.)
Anticoagulante:

EDTA (dentro de 24 hs.) o Heparina (ms de

Conservacin: temperatura ambiente.

Hemlisis.
Tener
en cuenta:
Presencia de cogulos
Hemodilucin ( volumen de la muestra inferior a 3 ml)
Viabilidad celular: depende de anticoagulante utilizado, tiempo

y temperatura hasta / durante el procesamiento, mtodos de


procesamiento, ciertas condiciones que aceleren la muerte
celular (terapia recibida, tumor con alta tasa de proliferacin).

>24 horas. Un resultado positivo siempre es informativo a pesar

de la baja viabilidad, y ante un resultado negativo, se har


constar en el informe (los granulocitos pueden degranularse con
el pasar del tiempo).

Muestra coagulada, no puede ser rechazada, pero los resultados

obtenidos debern ser tomados con precaucin.

Muestra anormalmente rotulada. Se debe clarificar la situacin

especficamente con el personal que obtuvo la muestra. Si no


puede ser confirmada la identificacin de la muestra, debe
rechazarse.

Inspeccin inicial de la muestra: hemlisis, cogulos,

temperatura extrema, muestra mal rotulada

Lisis de eritrocitos: se recomienda lisis posterior al marcado.

celular.
Ajuste del nmero de clulas: 0,5 106 cl. / tubo.Ver viabilidad
Adquisicin de datos: no menos de 50000 eventos totales

no menos de 100 eventos en la poblacin de inters.

El panel debe permitir distinguir todas poblaciones celulares

presentes en la muestra, an las menos frecuentes, en todos los


estadios madurativos (precursores mieloides, linfoides y
eritroides y clulas maduras
de los
linajes mieloides,
monocitoides y linfoides)

Deber identificar anomalas feneotpicas presentes en las

distintas lneas celulares ( sobreexpresin, subexpresin


ausencia de Ag, asincronismo madurativo, infidelidad de linaje).

Deber ser suficientemente amplio para identificar la presencia

de clulas anormales, an las no sospechadas originalmente por el


mdico y caracterizar en forma completa la poblacin anormal
detectada.

FITC

PE

PerCP/PECy5.5

APC

CD16

CD13

CD45

CD11b

CD15

CD33

CD45

CD34

Precursores.Seriegranulocticay
monoctica.

CD36

CD64

CD45

CD14

Maduracinmonoctica

HLA-DR

CD11b

CD45

CD34

Maduracinmonocticay
granuloctica

CD71

CD36

CD45

CD34

Precursoresymaduracin
eritroide

CD71

CD13

CD45

CD34

Precursores(mieloides,eritroides
ylinfoides)

HLA-DR

CD117

CD34

CD38

Precursoresmieloidestempranosy
dediferenciacin,mastocitosy
clulasplasmticas.

HLA-DR

CD123

CD45

CD34

Clulasdendrticas,basfilosy
susprecursores.

CD5

CD7

CD34

CD56

Precursores.Agsaberrantes.
LinajelinfoideTyNK

CD3

CD8

CD45

CD4

CD10

CD20

CD19

CD34

Maduracingranuloctica

PoblacinlinfoideT
PrecursoreslinfoidesB

PacB

PacO

FITC

PE

PerCPCy5.5

PECy7

APC

APCH
7

HLA-DR

CD45

CD16

CD13

CD34

CD117

CD11b

CD10

Maduracinneutrfiloy
PNH.

HLA-DR

CD45

CD35

CD64

CD34

CD117

IREM2

CD14

Maduracinmonocitoy
PNH

HLA-DR

CD45

CD36

CD105

CD34

CD117

CD33

CD71

Maduracineritroide

HLA-DR

CD45

TDT

CD56

CD34

CD117

CD7

CD19

MaduracinBy
aberranteAgslinfoides

HLA-DR

CD45

CD15

NG2

CD34

CD117

CD22

CD38

Expresinaberranteen
stemcells

Distribucin de las poblaciones en MO normal


Poblacin
CD34+

(n=12)

1.1 + 0.6 (0.3-2.6)

CD34+ or CD117+

2.2 + 1.4 (0.6-6)

Clulas eritroides
Neutrfilos

4.7 + 2.1 (2-9)


67 + 6.1 (57-80)

Monocitos

4.3 + 1.4 (2-6.5)

Eosinfilos

2.5 + 1.3 (0.8-5)

Basfilos
Mastocitos

0.4 + 0.7 (<0.1-2.4)


0.02 + 0.01 (<0.03)

Cl plasmticas

0.2 + 0.2 (0.01-0.5)

LB maduros

2.9 + 1.5 (1.6-6.3)

Precursores B
LT

0.9 + 0.8 (0.1-3.9)


9.2 + 4.5 (2.6-18)

Clulas NK

2.8 + 1.4 (0.7-5)

a- Se seleccionan las clulas en Gate CD34+ CD34/SSC


b- En un segundo paso, se excluyen las clulas NO viables en FSC/SSC.
c- El perfil de CD45/SSC permite constatar pureza de la poblacin seleccionada.

Precursores
mieloides CD34+
Precursores linfoides
CD34+

El porcentaje de precursores CD34+ linfoides


se informa sobre el total de CD34+. Se
considera anormal <5% del total de las
CD34+.

Valores normales para las distintas


subpoblaciones de CD34+
Linaje celular
Inmaduras
Eritroide
Megacarioctica
Neutrfilo
Eosinfilo
Basfilo
Monoctico
Mastocitos
Cel. dendrtica plasmocitoide
Linfoide B

Frecuencia

52% (19-66%)
15% (5%-35%)
1%
31% (12%-39%)
1%
1% (1%-3%)
5% (3%-15%)
1%
6% (1%-15%)
14% (1%-45%)

Precursores inmaduros
Precursores B
Precursores neutrfilos

T-SSC

Precursores en MO normal

CD34+ HPC
CD45-PerCP

Progenitores mieloides CD34+

Aumento relativo y absoluto de clulas CD34+.


Aumento relativo y absoluto de clulas CD34(-)CD117(+).
SSC anormal (granularidad).
Expresin anormal de CD45 (-, o ).
Expresin anormal de CD34 (-, o ).
Expresin anormal de CD38 (- o ).
Expresin asincrnica de CD11b y/o CD15.
Prdida o sobreexpresin de expresin de CD13,CD33 o DR.
Expresin de Antgenos Linfoides: CD5, CD7, CD19 o CD56.

Progenitores CD34(+) linfoides B

Disminucin o ausencia relativa y absoluta de clulas


Ausencia de expresin de CD79a.

CD19(+)CD10(+)

MO normal

Mieloides

Linfoide
B

Inmaduras

Mieloides

Eritroide
s
Linfoides B

MO patolgica

MO normal

HLA DR CD123 CD45

CD11b CD13 CD45 CD34

MO patolgica

CD34 APC

CD123-PE
HLA DR-FITC

CD45-PerCP Cy5.5

Hipogranularidad (SSC )
Anormalidad en los patrones de maduracin (CD16/CD13,

CD11b/CD13)

Asincronismo CD10/CD16
Ausencia o disminucin de CD13 o CD33.

Expresin de CD34, CD117, HLA-DR.

de Ag. Linfoides.
Expresin disminuida
de CD45.
Desvo asincrnico hacia la izquierda.

Cambios fenotpicos en la diferenciacin mieloide normal


MYELOBLAST

PROMYELOCYTE

MYELOCYTE

METAMYELOCYT

BAND/
NEUTROPHIL

CD13
CD13
CD15

103

CD11b

CD33

CD35
102

CD65

CD64

101

CD16
CD34
CD117
HLA-DR

CD54

CD10

Patrn normal

Patrones alterados

Patrn Normal

Patrones alterados

SSC anormal (granularidad).


Patrones anormales de HLA-DR/CD11b, CD64/CD36/CD14,

DR/CD33, CD11b/CD13.

Prdida de expresin de CD13, CD14 y CD33.

Expresin de CD34.
Expresin de Ag. Linfoides (con excepcin del CD4).

Disminucin de la expresin de CD45.

Expresin de CD56.

Cambios fenotpicos en la diferenciacin monoctica normal

MONOBLAST

PROMONOCYTE
CD14
CD45
CD11c
CD36
CD11b

HLA-DR
CD34
CD64
CD117

MONOCYTE

CD64-PE

CD14 APC

CD13 PE

Diferenciacin monoctica

CD14++
CD36-FITC

CD36 FITC

CD11b FITC

CD36 CD64 CD45 CD14


MO normal

MO patolgica

Aumento del % de clulas eritroides nucleadas.

Alterado patrn CD71/CD235a.

Expresin
Expresin anormal
anormal de
de CD71,
CD45. CD117 o CD36.

Expresin de CD34.

Cambios fenotpicos de la diferenciacin eritroide

INMATURE

MATURE
CD36
GphA

CD71
CD34
CD117
HLA-DR
CD45
CD13
CD33

Disminucin de la expresin de CD71 y/o CD36


Aumento de la proporcin de lnea eritroide con expresin

30% del total de las clulas seleccionadas como eritroides).

CD117 (ms de

Expresin aberrante de antgenos linfoides: CD5, CD7, CD19, CD56.

Resultados:
% de clulas CD34(+)
% de clulas CD34(-)CD117(+)
% de granulocitos.
% de monocitos
% serie eritroide
% de otras clulas identificadas.
Fenotipo conservado o alterado de las clulas CD34(+). Presencia o

ausencia de hematogonias.
Patrn madurativo conservado o alterado en serie granuloctica,
monoctica y/o eritroide.

Conclusiones:

Sin evidencia fenotpica que sugiera proceso mielodisplsico.


Evidencia fenotpica de desorden mieloide clonal sugerente de

SMD.

Presencia de blastos o clulas atpicas: evaluar todos las lneas

celulares.

Citopenias: evaluar todos las lneas celulares.


Descartar algunos SLPC-B que se presentan con citopenia.
En anemias aisladas la CF no est indicada de primera instancia.
Leucocitosis:
Monocitosis
Eosinofilia
Neutrofilia: solo en presencia de blastos.
Policitemia, trombosis o basofilia: la CF no est indicada en

primera instancia ( frecuentemente asociadas a patologas no


neoplsicas o en patologas en las que la CF no aporta datos
relevantes).

Displasia multilinaje:
Malnutricin
Falla multiorgnica
Drogas inmunosupresoras o citotxicas.
Abuso de alcohol
Deficiencia de Vit B12 o Acido Flico.
Sobreexpresin de CD64 en sepsis.
Ausencia de CD16 en granulocitos: descartar PNH.

Ausencia de CD14 en monocitos: descartar PNH.

La muestra para el estudio de SMD por CF debe ser el aspirado de

mdula sea.

Evaluar todas las poblaciones presentes en MO, por lo menos las

mayoritarias, con amplios paneles de Ac. Monoclonales.

Los datos obtenidos por CF deben ser capaces de categorizar MO

como normal o posiblemente compatible con SMD o desorden


mieloide clonal.

La CF en SMD puede ser slo usada como una parte del diagnstico.

No existe un marcador diagnstico especfico para SMD.

El grado de asociacin de las alteraciones fenotpicas con los

SMD es variable.

Un

mayor nmero de alteraciones en los precursores


hematopoyticos muestran un mayor grado de especificidad
diagnstica y tambin se asocian con peor pronstico.

Repetidos

estudios pueden ser necesarios en casos no


concluyentes y tambin para monitorear el curso de la
enfermedad tanto en pacientes de bajo riesgo no tratados como
en los pacientes con tratamiento.
La coincidencia de los SMD con otras patologas como SLP,
mastocitosis y HPN deben ser considerados.
Tener en cuenta que las citopenias pueden ser causa de otras

patologas como leucemias agudas, anemias aplsicas y algunos


SLPC como la Tricoleucemia.