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Universidade Federal do Rio Grande

Faculdade de Medicina
Fisiologia Humana
Ramatis de Oliveira

Transfer of carbohydrate-active enzymes from


marine bacteria to Japanese gut microbiota
Jan-Hendrik Hehemann
Galle Correc
Tristan Barbeyron
William Helbert
Mirjam Czjzek
Gurvan Michel
Vol 464|8 April 2010|doi:10.1038/nature08937

Estao Biolgica Roscoff

https://maps.google.com/maps?hl=pt-PT&safe=off&q=estao%20biolgica%20roscoff&um=1&biw=1600&bih=732&ie=UTF-8&sa=N&tab=il

http://pos-darwinista.blogspot.com.br/2010/06/genoma-de-alga-marrom-revela-como-vida.html

Ectocarpus siliculosus
Aqui crescendo em Zostera, alga marinha de que se extrai soda, ocorre
principalmente ao longo da costa em latitudes temperadas. (Crdito: Foto
por Akira Peters, Estao Biolgica Roscoff)

http://www.natuurlijkmooi.net/schotland/wieren/delesseria_sanguinea.htm

Delesseria sanguinea
Comum em rochas de regies de piscinas profundas e escuras.

http://bioinformatics.psb.ugent.be/genomes/view/Zostera-marina

Zostera Marina
Encontrada em substratos arenosos ou em esturios ou parcialmente
submersas flutuantes.

http://www.johnsbooks.org/photo/photography1.htm

Porphyra umbilicalis
Encontrada em diversas regies costeiras pelo mundo.

http://www.aphotomarine.com/red_seaweed_gracilaria_gracilis.html

Gracilaria gracilis
Encontradas em regies intertidais.

http://waste.ideal.es/gelidiumspinosum.htm

Gelidium spinosum
Encontrada em rochas e lagoas costeiras.

http://toonrzrz.wordpress.com/page/2/

Chondrus crispus
Mar rtico.

http://www.marlin.ac.uk/speciesinformation.php?speciesID=3995

Laurencia pinnatifida
Costas rochosas da Gr-Bretanha e Irlanda.

Procedimentos

Algas coletadas em Roscoff durante mar baixa;


Lavadas exaustivamente com gua doce;
Choque trmico com nitrognio lquido; e
Modos num almofariz at o estgio de p.
Foram utilizados 100g de material seco para obter
polissacardeos.

http://www.portais.ws/?page=art_det&ida=29505

Procedimentos

O p foi tratado com etanol 80%;


Centrifugado; e
o etanol descartado.
Repetio at o sobrenadante ficar incolor.
A frao obtida foi sedimentada, congelada e secada por
liofilizao*

* Liofilizao ou criodessecao (Freeze drying, em ingls) um processo


de desidratao usado para preservar alimentos perecveis, princpios ativos,
bactrias, etc, onde estes so congelados e a gua retirada, por sublimao,
sem que passe pelo estado lquido.

Procedimentos
Para os testes de atividade enzimtica foram
utilizados 50g de algas em p;
Foram ressuspensas em 1mL de gua destilada.
Extraiu-se a suspenso aps 1h a 98C.
A suspenso foi centrifugada por 5min a 3.000 g e
Transferida para um novo tubo.
O processo foi feito em 3 parcelas de cada alga e os
produtos ps-centrifugao foram misturados.

Procedimentos
A massa seca foi recuperada de cada extrato, para
calcular a atividade enzimtica e para gravar os
espectros e 1H-RMN*.
*Prton de RMN (ou hidrognio-1RMN ou 1H-NMR), a aplicao de
ressonncia magntica nuclear, em espectroscopia, em relao ao hidrognio
dentro dos ncleos de molculas de uma substncia, a fim de determinar a
estrutura das suas molculas. Nas amostras em que o hidrognio utilizado,
praticamente todo o hidrognio constitudo pelo istopo 1H (hidrognio-1,
ou seja, tendo um prton por ncleo).

Procedimentos
Cem microlitros de extrato de algas foram incubados com, 1
mg de enzima a 30C em 300 mM de NaCl e 10 mM acetato de
sdio, 16 mM de citrato trissdico (pH 7,2) at que a digesto
completa pudesse ser obtida.
Digesto completa foi monitorizada com adio de enzima e
remedio da quantidade de oligossacardeos liberados. As
amostras foram centrifugadas durante 30 minutos a 3.000 g,
para girar para baixo as partculas de gel no-digeridos, e
reequilibrados durante 20 minutos a 20C.
Produtos de reao solveis no sobrenadante foram
quantificados por um redutor de acar.
A quantidade de reduo so apresentados em glicose
equivalentes.

Procedimentos
Clonagem da Zobellia galactanivorans;
Duas enzimas (Zg2600 e Zg3628) ;
foram amplificadas por PCR* e subsequentemente
clonadas.
Todos os alvos foram tratados com PCR
temperatura de 70C.
*Reao de Polimerizao em Cadeia (tcnica de replicao sequencial de
DNA in vitro).

Procedimentos
Os produtos foram digeridos com uma mistura de restrio
correspondente enzima/sistema amortecedor durante 3 horas a 37C.
Aps a digesto, os produtos de PCR foram novamente purificados
com um kit de purificao de DNA padro e, finalmente, eluiu-se
com 25 L de H2O.
Ligados com plasmdeo* pET15b-derivado, desfosforilado.
Para transformao quimicamente compoetente de clulas DH5 E.
coli foram utilizadas seguindo padres.
* Os plasmdeos ou plasmdios so molculas circulares duplas de DNA capazes
de se reproduzir independentemente do DNA cromossmico. Ocorrem geralmente
em bactrias e por vezes tambm em organismos eucariticos unicelulares.

Procedimentos
Os clones obtidos foram transformados em clulas
BL21 recombinante e, depois, inoculado 3 ml de
Luria-Bertani, caldo pr-cultura, suplementado com
100 gml-1 de ampicilina*.
A pr-cultura foi incubada durante a noite a 37C e
foram transferidos 10 L (de ampicilina) para
inoculao de 2 mL de ZYP-5052 (indutor de
expresso de protenas).
* Antibitico da famlia da penicilina (-lactmico).

Procedimentos
As culturas foram incubadas a 20C por trs dias e
colhidas por centrifugao.
As clulas foram lisadas com 500 ml de tampo de
lise (composta por 50 mM Tris*, pH 8, 300 mM
NaCl).
O lisado celular foi centrifugado e o sobrenadante foi
separado por purificao por afinidade em lotes com
resina de nquel hypercel.
* Composto orgnico utilizado como soluo tampo.

Procedimentos
O remanescente foi extrado com 6 M de ureia durante 30 minutos e centrifugouse. O
sobrenadante foi armazenado durante a eletroforese*.

O lisado celular sobrenadante foi utilizado para purificao por


afinidade em lotes
50 ml resina de nquel hypercel carregada adicionados ao sobrenadante.

incubao durante 20 min, o sobrenadante foi descartado e o


sedimento lavado com 500ml de tampo (sem lisozima DNase),
seguido
de
centrifugao.
* Separao de substncias utilizando-se a eletricidade num meio que as mantm em suspenso.

Procedimentos
As protenas ligadas foram eludas por adio de 500 mM de soluo
imidazol*.
Cristalizao: PorA foi cristalizado pelo mtodo de gota suspensa em
18-20% de PEG 4000**, 0,2 M de sulfato de amnio e 0,1 M acetato
de sdio, pH 4,6, a 20C.
Gotas continham 2 mL de 2,6 mg ml -1 soluo de protena mais 1 ml
de soluo de cristalizao e foram equilibradas contra 500ml
soluo de cristalizao.
* Substncia alcaloide.
** Os Polietilenoglicis so polmeros de baixo peso molecular obtidos a partir da
reao de polimerizao do xido de Etileno em presena de um iniciador (Etileno
Glicol, lcool ou gua) e tambm um catalisador.

Procedimentos
Cristaizao: PorB a 33-35% de PEG 1000, 0,4 M
de ltio sulfato e de 0,1 M de tampo MES a pH 6,0.
As gotas de estar foram formados por 2 ml de mistura
de soluo de protena (5,6 mg ml -1) E 1 ml de uma
soluo de cristalizao, e equilibrou-se contra uma
soluo de cristalizao de 500 ml de 20C.
Por crioconservao, os cristais foram levados a
glicerol a 10% em incrementos de 5% na soluo de
cristalizao.

Procedimentos
Purificao dos oligossacardeos;
As amostras de oligossacardeos foram analisadas
com ressonncia magntica nuclear;
Sequenciamento e anlise filogentica.

O Caso
Pesquisadores descobriram uma nova classe de
enzimas (CAZimas) que degradam polissacardeos
sulfatados estudando a bactria marinha Zobellia
galactanivorans.

O Caso

Estes polissacardeos sulfatados fazem parte da


constituio da parede celular das algas.
Muitas espcies de algas so consumidas pelo
homem:

O Caso
Entretanto, o problema do consumo de algas a
digesto desses carboidratos, devido presena de
grupos sulfatos.

A Descoberta

Os cientistas sequenciaram o genoma da bactria Z.


galactanivorans e encontraram 5 protenas
responsveis por degradar os carboidratos das algas.
Sendo que duas delas so responsveis por degradar
os carboidratos da alga Nori.

A Descoberta
Os pesquisadores resolveram ento procurar em bases
de dados outras bactrias que degradassem estes
carboidratos.
E eles encontraram mais 6 bactrias.
Curiosamente, uma no era bactria marinha como
a Z. galactanivorans, mas uma espcie encontrada na
microbiota de seres humanos mais especificamente,
de japoneses!
A Bacteroides plebeius.

Testes em humanos
O genoma do intestino de 13 japoneses e 18 norte
americanos foi analisado. Sendo que nenhum norte
americano apresentou a enzima, e 7 japoneses sim.

Como a bactria conseguiu essa enzima?


Atravs de transmisso horizontal de genes, na qual
uma bactria pode adquirir genes de outras bactrias
que no sejam suas ancestrais diretas.
Um dos indivduos da pesquisa foi uma bebe j
desmamada que apresentou os genes que codificam a
enzima. Indicando tambm a transmisso vertical
(entre geraes)!

Concluso
Levando em conta que tais enzimas esto ausentes no
meio terrestre, presume-se que a aquisio de
bactrias que digerem polissacardeos de algas
relativamente recente dentre os humanos.
Alm disso, a alga Nori a nica fonte possvel de
polissacardeos digeridos por estas enzimas. Ou seja,
provavelmente estas bactrias devem ter sido
adquiridas pelos japoneses atravs do consumo desta
alga.

Concluso
H tempos fala-se na possibilidade de a microbiota
intestinal trocar genes com microrganismos do
ambiente. Mas isso era apenas uma hiptese provvel,
mas nunca demonstrada at este artigo.
Essa transferncia importante para a evoluo, uma
vez que permite o aproveitamento de nutrientes que
anteriormente no teriam valor para humanos.

Reflexes
Ento, voc, ocidental, que gosta de comer sushi e
outros pratos base de algas, fique sabendo: voc
NO digere os polissacardeos destas algas.
Aps observar a metodologia utilizada, ficam am
perguntas: Com tantas etapas artificiais, com tantas
intervenes qumicas e fsicas, qual a utilidade
dos resultados obtidos? No que isso tudo que foi
feito se assemelha ao que ocorre in natura? A
respostas seria visualizar indcios?