Electroforesis

Antecedentes
El

termino de electroforesis se refiere a una tcnica

separativa que emplea un campo elctrico aplicado que
acta
sobre
partculas
cargadas
causando
su
movimiento a travs de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue
desarrollado por Tiselius en 1937.

La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que

se utiliza una corriente elctrica controlada con la
finalidad de separar biomolculas segn su tamao y
carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.

Se emplea por primera vez en el ao 1937, pero su

importancia vino a incrementarse cuando en los aos
cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius, impulsaron la
electroforesis de zona, nombre que se asigno a la
separacin de materiales en un campo elctrico en
presencia de algn tipo de soporte;

aunque este termino se limito originalmente al anlisis

de coloides y partculas submicroscopicas, se ha
convertido en estos ltimos aos en una metodologa
aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

Fundamentos

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga

neta son colocadas en un campo elctrico el voltaje
aplicado se expresa en voltios por centmetro.
Este es de hasta de 500 V en electroforesis de bajo
voltaje, y puede ser de varios miles de voltios en la
electroforesis con alto voltaje. Esta ltima se usa para
tener separaciones rpidas de sustancias de bajo peso
molecular.

La energa cintica de las molculas aumenta con la

temperatura, por ello a mayor temperatura mayor
difusin.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las
molculas no migren de una manera homognea, de tal
manera que, si las molculas son colocadas en un cierto
lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse
formando un frente cuya anchura aumentara con el
tiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el

movimiento de las molculas empleando un medio que
oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma
comn de hacer esto es formar un gel.

El gel consiste en un polmero soluble de muy alto peso

molecular que atrapa molculas de agua y forma un
tamiz que dificulta el movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migracin electrofortica de las
molculas ser mas lenta, pero el ensanchamiento del
frente se vera reducido tambin.

La electroforesis capilar (CE)

Tcnica de separacin que se ha desarrollado gracias a los avances
de la cromatografa lquida de alta eficacia junto con los
procedimientos ms tradicionales de electroforesis.
Esta tcnica permite separar bastante bien biomolculas, donde la
cromatografa lquida se muestra menos eficaz, y compuestos de
pequea masa molecular, difciles de estudiar por los
procedimientos clsicos de electromigracin en soporte.

Electroforesis capilar

se basa en la migracin de las especies de la muestra en

disolucin, portadoras de una carga elctrica global, bajo el efecto
de un campo elctrico y en contacto con un soporte (medio de
desplazamiento) adecuado.

Mtodos

Hay varios tipos de electroforesis de zona, de

acuerdo con los diferentes soportes.
Entre los soportes comunes estn los geles de
almidn,
geles de poliacrilamida,
espuma de poliuretano
y papel.

Mtodos electroforticos zonales.

Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad

en diferentes campos. Son tiles para lograr la
separacin de mezclas complejas. Se aplican
pequeas cantidades de la disolucin de
protenas a un soporte slido, que se impregna
con una solucin tampn.
Los soportes en general son polmeros y forman
un gel poroso que restringe el movimiento de las
molculas a travs del medio durante la
electroforesis y disminuyen los flujos de
conveccin del solvente.

Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los geles de poliacrilamida se forman por

polimerizacin de la acrilamida por accin de un
agente entrecruzador, es qumicamente inerte,
de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible.
Forma,
adems,
geles
transparentes
con
estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena
visualizacin de las bandas durante un tiempo
prolongado.
Adems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de polmeros, se puede modificar
de manera controlada en el tamao del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en
diagnostico debido a su neurotoxocidad.

Electroforesis en geles de gradientes.

El uso de geles de poliacrilamida que
tienen un gradiente creciente de
concentracin de achrilamida +
bisacrilamida, y en consecuencia un
gradiente decreciente en el tamao
del poro, pueden tener ventajas
sobre los geles de concentraciones
uniformes de acrilamida.

En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona

donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se
alcanza el limite del poro no se produce una migracin apreciable
aunque no se detiene completamente.
Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las
bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de
incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden
resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin
fija.

Electroforesis en geles de agarosa

La agarosa es un polisacrido (originalmente

obtenido de algas, como el agar-agar, pero
de
composicin
homognea),
cuyas
disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas
por encima de 50C y formar un gel,
semislido al enfriarse.
Este gel esta constituido por una matriz o
trama tridimensional de fibras polimricas
embebida en gran cantidad de medio
lquido, que retarda el paso de las
molculas, se usa usualmente para separar
molculas grandes de alrededor 20.000
nucletidos.

Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente
denominada
electroenfoqu
se basa en el desplazamiento
de las molculas en un
gradiente de pH.

Las molculas atmosfricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que

existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH .
La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un
gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico
dentro del rango.
Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto
isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras
aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico
tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una
regin dnde el pH coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se
detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas
donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

Procedimiento

El capilar se llena con una solucin reguladora. A un pH mayor de 2,

aproximadamente, los grupos silanol se ionizan y producen una carga negativa
en la superficie del capilar, llamada potencial zeta. Este potencial atrae
cationes de la solucin amortiguadora, los cuales forman una doble capa
elctrica a lo largo de las paredes

Cuando se aplica un alto voltaje de cd, las cargas positivas de la

fase mvil en la capa externa doble difusa migran en direccin del
ctodo. Como los iones estn solvatados, el fluido amortiguador es
arrastrado por la carga migrante y se forma un flujo de solucin
del disolvente masivo de hasta varios cientos de nanolitros por
minuto (dependiendo del pH, de la concentracin del amortiguador
y de otros factores que afectan al potencial zeta).

A esto se le llama
flujo electroosmtico (EOF, electroosmotic flow). Mientras
tanto, las molculas del analito estn sometidas a la movilidad
electrofortica, que consiste en que los cationes son
atrados hacia el nodo, y los aniones hacia el ctodo. Pero el flujo
de la solucin hacia el ctodo da como resultado el flujo
unidireccional de todos los analitos independientemente de su
carga.
Los iones pequeos con carga ms positiva migran ms rpido y
sern los primeros que se detectan. Las molculas neutras migran
al mismo flujo que el de la electrosmosis, porque no se aceleran ni
se retardan por el campo elctrico y no se separan.

video

Usos en la farmacia

La electroforesis permite saber la carga que poseen los

polipeptidos de la materia recombinante del ADN as como separar
los polipeptidos resultantes de las variaciones que se hagan en
laboratorio con el ADN recombinante.

Anlisis de protenas
La electroforesis ha desarrollado nuestro conocimiento sobre la
estructura y funcin de las protenas.

Anlisis de antibiticos
Estos estudios se efectuaron para mejorar las tcnicas
electroforticas y antibiticos nuevos. Con la electroforesis, los
expertos no slo son capaces de sintetizar nuevos antibiticos,
tambin son capaces de analizar qu tipos de bacterias son
resistentes a los antibiticos.

Anlisis de vacuna
La vacuna es un anlisis de las muchas aplicaciones importantes
de la electroforesis. Hay varias vacunas que han sido purificadas,
procesadas y analizadas a travs de la electroforesis, como la
vacuna contra la influenza, la vacuna contra la hepatitis y la
vacuna contra la polio. los informes de datos de los fabricantes de
vacunas, como Wyeth, Merck y Sanofi-Aventis presentan la
electroforesis como un mtodo de anlisis eficaz de la vacuna.

elaboracin de un protocolo y
reporte de validacin de un
mtodo analtico

ESCRIBIR UN PROTOCOLO DE
VALIDACIN DE MTODOS DE ENSAYO

Propsito

Visin de conjunto

Recursos

Apndices

PROTOCOLO

- Plan Experimental

Control de materias primas

Material de referencia

Verificacin, calibracin y control del equipamiento

Entrenamiento del personal

Procedimiento normalizado de operacin del mtodo

CONTROL DE MATERIAS PRIMAS

procedentes de casas comerciales reconocidas

forma detallada las especificaciones de la

muestra de ensayo

la preparacin

estabilidad de las disoluciones, diluciones, pH y

temperatura.

MATERIA DE REFERENCIA

utilizarn para la calibracin del sistema de medicin

se utilizarn materiales de referencia secundarios contra

un material de referencia primario.

Proponen una caracterizacin de una parte de un lote

industrial para emplearlo como patrn de trabajo en
determinaciones cuantitativas.

Material de referencia que se utilizara aparecern como

anexo

VERIFICACION, CALIBRACION, y CONTROL

DEL EQUIPAMIENTO

En las Farmacopeasaparecen reportados los mtodos para

realizar la calibracin y/o control

desarrollan la validacin de los equipos analticos para

satisfacer los requisitos internacionales

el usuario debe desarrollar su propio procedimiento para la

comprobacin del buen funcionamiento del instrumento o
seguir las recomendaciones del fabricante.

equipo est verificado se realiza un simple control de rutina.

ENTRENAMIENTO DEL PERSONAL

El personal encargado de realizar los ensayos

analticos estar entrenando especficamente
en este tipo de trabajo y su entrenamiento
estar rigurosamente documentado.

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE
OPERACIN DEL METODO

Refleja el procedimiento exacto de ejecucin del

mtodo analtico y estar anexado al protocolo de
validacin.

VALIDACION

Selectividad (Especificidad)
Linealidad
Rango
Exactitud
Precisin Repetividad
Idoneidad del sistema

ESPECIFICIDAD

La especificidad del mtodo de ensayo se

investiga mediante la inyeccin del placebo
extrado para demostrar la ausencia de
interferencia con la elucin del analito

imprimir los cromatogramas

Los compuestos de excipiente no deben interferir

con el anlisis del analito

LINEALIDAD

tpicamente 25, 50, 75, 100, 150, y 200% del

concentracin.

Tres repeticiones preparados de forma individual

se analizar de cada concentracin.

Calcula la media, la desviacin estndar y la

desviacin estndar relativa (RSD) para cada
concentracin.

RANGO

Los datos obtenidos durante la linealidad y

exactitud estudios se utilizarn para evaluar el
rango del mtodo.

Registrar el rango en una hoja de datos

EXACTITUD

muestras adicionadas sern preparados en tres concentraciones

en el rango de 50 a 150%

Tres repeticiones preparados de forma individual a cada

concentracin ser analizado.

Para cada muestra, informar el valor terico, ensayo valor, y el

porcentaje de recuperacin. Calcula la media, la desviacin
estndar, RSD, y el porcentaje de recuperacin para todas las
muestras.
Registrar los resultados en la hoja de datos.

PRECISIN - REPETIBILIDAD

Una solucin de muestra que contiene el nivel de

analito estar preparado.

Diez repeticiones

Registra el tiempo de retencin, rea y altura de

pico en la hoja de datos.

Calcular la desviacin estndar, media y RSD.

IDONEIDAD DEL SISTEMA

pruebas de idoneidad del sistema se llevar a

cabo para determinar la exactitud y la
precisin de la sistema seis inyecciones de
una solucin que contiene analito en el 100%
de concentracin de ensayo.

Imprimir el cromatograma y registrar los datos

en la hoja de datos

ROBUSTEZ

robustez mide la capacidad de un mtodo analtico

para no ser afectado por variaciones pequeas pero
deliberadas de los parmetros del mtodo.

Gradiente
pH
La concentracin del tampn
La temperatura
Volumen de inyeccin.

APNDICES