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INTRODUO AOS MTODOS

CROMATOGRFICOS

Classificao dos mtodos


analticos
CLSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em
Chamados de
propriedades fsicas
mtodos de via
(qumicas em alguns casos )
mida
Cromatogrfic
Gravimetri Volumetria Eletroanaltic
o
a
o
Espectromtrico

Propriedades Propriedades Propriedad


eltricas
pticas
es mistas*

*Separao: interaes fsico-qumicas.

Identificao/quantificao: propriedades pticas ou eltricas.

Cromatografia
Histrico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botnico russo: Separao de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos e
ter de
solventes variados.
petrleo

mistura de
pigmentos
CaCO3

pigmentos
separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia
Definio - Princpio Bsico

Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao de


misturas. A identificao e quantificao de seus
componentes fica por parte do detector.
A separao depende da interao dos componentes da
mistura com a fase mvel e com a fase estacionria.
A interao dos componentes da mistura com estas duas
fases influenciada por diferentes foras
intermoleculares, incluindo inica, dipolar, apolar, e
especficos efeitos de afinidade e solubilidade.
A identificao se d mediante a comparao da interao
de padres com as fases estacionrias.
A quantificao feita tambm pela comparao com
padres de concentraes conhecidas, atravs de curvas
analticas.

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com o sistema cromatogrfico
Em Coluna
Cromatografia Lquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrtica
Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com a fase mvel
Utilizao de Gs
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR)
Utilizao de Lquido
Cromatografia Lquida Clssica (CLC)
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)
Utilizao de Gs Pressurizado
Cromatografia Supercrtica (CSC)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com a Fase Estacionria
Lquida
Slida
Quimicamente Ligadas
De acordo com o modo de separao

Por Adsoro
Por Partio
Por Troca Inica
Por Afinidade

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
Tcnica

Planar

FM

Lquido

FE

Lq

Tipo de
cromatografia

Sl

Coluna

Gs

Lq

Sl

CP CCD CGL CGS

Lquido

Lq

Sl

CLL CLS

Troca
Inica

Afinidade

Fase
Ligada

Excluso

CTI

CB

CLFL

CE

Cromatografia
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou
slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).

CROMATOGRAFIA LQUIDA

Na Cromatografia lquida a fase mvel um lquido


que se desloca sobre uma fase slida (estacionria).
Pode ser dividida em duas partes. Cromatografia
planar e cromatografia em colunas. Na cromatografia
planar temos a Cromatografia em Papel (CP, em ingls
PC) e a Cromatografia em Camada Delgada (CCD em
ingls TLC).
Na
cromatografia
em
colunas
temos
a
Cromatografia Lquida clssica (CL, em ingls LC) e a
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE, em
ingls HPLC).

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!
Fase estacionria lquida suportada na celulose.

Fase mvel

Separao

A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio, utiliza dois lquidos


(lquido-lquido) sendo um fixado em um suporte slido (papel de filtro). Um bom
exemplo a separao da tinta verde. Com o processo de cromatografia possvel
verificar que a cor verde uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, bem


simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separao e identificao de compostos polares hidrossolveis.

DEFINIES E TERMOS USADOS EM


CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Cromatografia em papel (CP): Mtodo fsico-qumico de separao dos
componentes de uma mistura, em funo do deslocamento diferencial de
solutos, arrastados por uma face mvel, sendo retidos seletivamente por uma
fase estacionria liquida (gua), na cromatografia com fase normal.
Suporte: Papel sobre o qual fica retida a fase estacionria, gua.
Fase mvel: Um liquido ou mistura de liquides que fluem atravs do papel,
arrastando os solutos.
Revelador ou Agente Cromatogrfico: Agente fsico (U.V., por exemplo) ou
quimico (por ex., vapores de iodo) que tornam visveis as substncias
separadas pela cromatografia em papel.
Resoluo: Distncia mnima em que se encontram duas manchas sendo
ainda possvel distingui-las individualmente.
Desenvolvimento: o movimento diferencial dos componentes de uma
amostra, ao serem deslocados pela Fase mvel Em funo de sua direo
podemos ter: ascendente, de baixo para cima; descendente, de cima para
baixo; horizontal, do centro para a periferia conforme um circulo imaginrio
traado no plano horizontal.

Aplicao: Colocao da soluo da amostra (mistura das substncias) no


ponto de partida sobre o papel cromatogrfico.
Frente da fase mvel: Linha de chegada da fase mvel, visvel ainda
quando se retira o papel da cuba cromatogrfica.
Distncia percorrida: Distncia percorrida pela fase mvel, desde o ponto
de partida ate a linha de chegada (geralmente 10 cm) ou a do componente,
no mesmo tempo.
Rf: O quociente entre as distncias percorridas simultaneamente desde o
ponto de partida, ate o centro de maior concentrao da mancha do soluto
e ate a frente da fase mvel.
Cmara ou Cuba cromatografica: Recipiente de vidro com tampa
fechada hermeticamente, no deixando escapar vapores da fase mvel e
onde coloca-se o papel de cromatografia.
Cromatograma: Papel com as substancias separadas.
Saturao da cuba: Distribuio uniforme no interior da cuba da fase
vapor da fase mvel aps alcanado o equilbrio (para obter-se a saturao
deve-se colocar papis de filtro, embebidos na fase mvel, aderidos as
paredes laterais internas das cubas).

PAPEL
O suporte na cromatografia em papel uma tira retangular ou uma folha
circular de papel que funciona como uma camada fina de celulose.
Para usos especiais prefervel modificar-se o papel os mais utilizados
so:
Papel acetinado - til para separar substncias hidrfilas.
Papel impregnado - empregam-se na separao de substncias
moderadamente hidrfobas ou hidrfilas. O papel umedecido ou com
silicone, ou com parafina, ou com dimetilformamida ou aminas de alto
peso molecular.
Papel carregado - disperso de resinas poliestirnicas, trocadoras de
ions, nas fibras de celulose, permitindo a separao de substncias
orgnicas e inorgnicas.
Papel de fibra de vidro - as fibras de celulose so substitudas por
fibras de vidro, usa-se para condies extremas de temperatura e de
acidez e devem ser impregnados com suspenses aquosas de slica gel ou
alumina.
Papel tratado - para substncias anfteras ou com muitas hidroxilas.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Teve incio em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas comeou a ser
largamente utilizada na ddaca de 1960. O processo de separao est
fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro. Entretanto com fases
estacionrias tratadas pode ocorrer tambm por partio ou troca inica.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD


Termos e parmetros tcnicos

Smancha
Rf
Ssolvente
s
c
b
a

a
Rfa
s
b
Rfb
s

c
Rfc
s

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONRIAS
Slica (SiO2)
Alumina (Al2O3)

Ativao de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC

Celulose
Poliamida

Ativao de 10 min
a 105 oC

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

ANLISE QUALITATIVA
- Comparao com valores de Rf tabelados
- Comparao com padro eludo em conjunto
- Extrao e aplicao de mtodos instrumentais

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Concluses:
Amostra no contm a espcie B

Amostra pode conter a espcie A

Para se certificar da presena,


eluir em outros solventes
Amostra

A B

Aps
Eluio

Cromatografia em Camada Delgada -CCD


Aplicaes:
Estudos

preliminares dos componentes de


um extrato orgnico;
Investigao de casos de envenenamento e
ingesto de estimulantes por atletas;
Estudos de reaes qumicas quanto
presena de intermedirios estveis;
Anlise da pureza de compostos;
Anlise
da eficincia de processos de
destilao e cristalizao.

Tammy

Cromatografia em Camada Delgada -CCD


Vantagens:
Fcil

execuo;
Rapidez;
Menor trajeto da fase mvel ;
Baixo custo;
Versatilidade.
Desvantagens:

Difcil reprodutibilidade;
Difcil determinao precisa do Rf.
Tammy

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAO
Excluso

Partio

Adsoro

Troca Inica
Afinidade

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
- Fase Mvel Lq. ou Gs
- Fase Estacionria Slida
Processos de
Adsoro/Dessoro
Ligaes de hidrognio;
Foras de Van der Waals

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Diferena entre Absoro e Adsoro

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
Fase Estacionria Slida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

A funo das fases mveis na cromatografia por adsoro


tem sentido amplo:
a) Funo solvente

Solubilizar os componentes
Ter baixo ponto de ebulio

b) Funo eluente

Conduzir os componentes da mistura pela coluna


Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente


Hexano < ter de Petrleo < Ciclohexano <

Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <


Diclorometano < Clorofrmio < ter Etlico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < cido Actico

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
Usos:
a) Laboratrios de qumica orgnica separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em sntese.
b) Laboratrios de produtos naturais escala preparativa
e analtica.
c) Laboratrios de anlises clnicas separao de
esterides de urina ou de sangue, etc.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIO
Fase Mvel Gasosa
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua volatilidade.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua solubilidade.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

TROCA INICA

Por volta de 1935 comearam a ser fabricadas resinas de troca inica


orgnicas, muito eficientes, passando a constituir um meio qumico de
extraordinrio valor em processos analticos.

Fase Mvel Lquida


Fase Estacionria Slida
Processos de Troca Inica
Adsoro reversvel e
diferencial dos ons da fase
mvel pelo grupo trocador
da matriz

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Fluxo da FM

TROCA INICA
Resinas Catinicas
e Aninicas

FE altamente carregada
Maior Interao
ons de alta carga
ons de menor tamanho
A diferena de afinidade entre
os ons da FM pode ser
controlada por pH e fora inica

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

O ajuste do pH proporciona a separao das duas protenas

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria em Gel

Enquanto as partculas menores penetram nas


cavidades, as maiores vo sendo eludas
contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
A propriedade que distingue a cromatografia de excluso,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia que o recheio (FE) um gel no carregado
constitudo de macromolculas que tm ligaes cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles so insolveis.

- Separao de tamanhos especficos


- Separao de polmeros e protenas
- Determinao de Massa Molar

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
Caractersticas
desejveis para os Gis
- Inrcia Qumica:

No pode haver uma interao


qumica entre a matriz e o soluto.

- Estabilidade:

O gel deve suportar uso contnuo


quanto mantido em condies
brandas de temperatura e pH.

- Baixo teor de ons:

Grupos carregados interferem no


processo de separao.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Fluxo da FM

EXCLUSO
Tipos de Gis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
gar e Agarose

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

AFINIDADE
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Slida
Propriedades
Biolgicas e
Funcionais

Cromatografia
Teoria Bsica
Coluna cromatogrfica: srie de estgios independentes onde acontece o
equilbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionria e na fase
mvel:

Ocorre um quase-equilbrio entre o analito


sorvido na FE e dissolvido na FM.

KC

A FE
A FM

KC = Constante de Distribuio
[A]FE = concentrao do analito na FE
[A]FM = concentrao do analito na FM

Afinidade pela FE

[A]FE

MENOR RETENO !!!

Volatilidade

[A]FM

Cromatografia
Quantificao da eficincia
Supondo a coluna cromatogrfica como uma srie de estgios separados
onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e a FM:

Cada estgio de equilbrio


chamado de PRATO TERICO

O nmero de pratos tericos


de uma coluna (N) pode ser
calculado por:

tR
wb

Coluna mais
eficiente

Cromatografia
Quantificao da eficincia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TERICO (H)

Tamanho de cada estgio de


equilbrio

Valores tpicos de H e N:

(L = comprimento da coluna)
Capilares, L = 30 m
dc = dimetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionria em m

Empacotadas, L = 2 m

Valores de H para colunas capilares e empacotadas so prximos, mas


como L para capilares MUITO maior tipicamente elas so mais
eficientes

Resoluo
Uma outra medida quantitativa de separao de dois
componentes consecutivos num cromatograma
a resoluo ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e
calculada a partir da distncia que separa os
mximos dos picos divididos pela mdia das larguras de suas
respectivas bases, conforme apresentado na
Figura 4. A resoluo de uma coluna uma medida quantitativa
de sua habilidade em separar dois
solutos, e definida por :
RS = ( tRB tRA ) / [ ( WA / 2) + ( WB / 2 ) ]
= 2 ( tRB tRA ) / ( WA + WB )

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionria

Deteco
Fase mvel

Separao

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Injetor: submetido
temperatura
controlada
Fase mvel:
gs inerte

Detector:
submetido
temperatura
controlada
Coluna: contendo a
fase estacionria
est submetida
temperaturas
controladas

Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de
um gs ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gs.

Misturas cujos constituintes sejam


VOLTEIS (=evaporveis)

DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que
sejam termicamente estveis.

Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gs de arraste (FM)
INERTE: No deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionria ou superfcies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionria.

Impurezas tpicas em
gases e seus efeitos:
H2O, O2
hidrocarbonetos

oxida / hidrolisa algumas FE


incompatveis detector de
captura eletrnica
rudo no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa

CUSTO: Gases de
altssima pureza
podem ser muito
caros.

CUSTO

Requisitos - Gs de arraste (FM)

A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)

PUREZA

COMPATVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda


um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
Seleo de Gases de
Arraste em Funo
do Detector:

DCT

He , H2

DIC

N2 , H2

DCE

N2 (SS), Ar + 5% CH4

Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo
INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica
t = 0

Injeo instantnea:
t = x
t = 0

Injeo lenta:
t = x

Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1
2

1 - Septo (silicone)
3 2 - Alimentao de gs de
arraste)
4

3 - Bloco metlico aquecido


4 - Ponta da coluna
cromatogrfica

Cromatografia Gasosa
Injetor on column

1 - Ponta da agulha
da microsseringa
introduzida no incio
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
incio da coluna.
3 - Plug de vapor
de amostra forado
pelo gs de arraste a
fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa
Parmetros de injeo
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposio.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do


componente menos voltil.

VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado


fsico da amostra.
Slidos:
convencionalment
e se dissolve em
um solvente
adequado e
injeta-se a

COLUNA

Amostras
Lquidas

Amostras
Gasosas

empacotada
= 3,2 mm (1/4)

0,2 L ... 20 L

0,1 mL ... 50 mL

capilar
= 0,25 mm

0,01 L ... 3 L

1 L ... 100 L

Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeo
LQUIDOS: Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L
mbolo

agulha (inox 316)

Microsseringa de
10 L:
corpo (pirex)
corpo

agulha

Microsseringa de 1 L
(seo ampliada):
guia
mbolo (fio de ao
soldado ao guia)

Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pulverizado
(FE slida ou FE lquida
depositada sobre as partculas do
recheio)
CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (frao de m) de
FE lquida ou slida

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE
VAPOR (p0).
Estrutura qumica do analito

p0 = f

Temperatura
da
coluna

Temperatura da coluna

Presso
de
vapor

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE


(MENOR RETENO)

Velocidade
de
migrao

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
AUMENTO DA
TEMPERATURA DA
COLUNA

CONTROLE CONFIVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAO EM CG

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:

TCOL ALTA:

- Componentes mais volteis so


separados

- Componentes mais volteis no


so separados

- Componentes menos volteis


demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos

- Componentes menos volteis


eluem mais rapidamente

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
TEMPERATURA

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a


separao:
TFIM

R
TINI

tINI

Consegue-se boa
separao dos
componentes da
amostra em menor
tempo

TEMPO

tFIM

TINI - Temperatura Inicial


TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotrmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento

Cromatografia Gasosa

Programao linear de
temperatura
a) Isotrmico a 45 C;
b) isotrmico a 145 C;
c) programado de 30 C a 180 C

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Possveis problemas associados PLT:
VARIAES DE VAZO
DO GS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gs
aumenta com a temperatura.

DERIVA
(DRIFT)
NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilizao de
FE lquida

viscosidad
e

vaz
o

Cromatografia Gasosa
Fase Estacionria
REGRA GERAL: a FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel
prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separao adequada dos constituintes
da amostra

FE pouco Seletiva:
m resoluo mesmo com coluna de
boa eficincia

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria slida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE slida a ADSORO
A adsoro ocorre na
interface entre o gs de
arraste e a FE slida

Slidos com grandes reas superficiais


(partculas finas, poros)
ADSORO

Solutos polares
Slidos com grande nmero de stios
ativos (hidroxilas, pares de eltrons...)

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria lquida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE lquida a ABSORO
A absoro ocorre no interior
do filme de FE lquida
(fenmeno INTRAfacial)

Filmes espessos de FE lquida

ABSORO

Grande superfcie lquida exposta ao


gs de arraste
Interao forte entre a FE lquida e o
analito (grande solubilidade)

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria quirais
As propriedades fsico-qumicas dos ismeros ticos so
MUITO SIMILARES FE convencionais no interagem
diferencialmente com os ismeros ticos.

PRODUTOS BIOLGICOS -

Distino entre produtos de


origem sinttica e natural (natural = normalmente substncias
oticamente puras; sinttico = muitas vezes so misturas racmicas).

FRMACOS -

Em muitos frmacos apenas um dos ismeros ticos


tm atividade farmacolgica.

Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal
quando da passagem de substncias que no o gs de arraste.

Caractersticas ideais (desejveis):


1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por vrias
ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente at pelo menos
400 C.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazo.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. No destrutivo.

Cromatografia Gasosa
Detectores
REGISTRO
DE
SINAL
ANALGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.

Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT

UNIVERSAIS:

Geram sinal para


qualquer
substncia eluda.

DCE

SELETIVOS:

Detectam apenas
substncias
com determinada
propriedade
fsico-qumica.

DNP

ESPECFICOS:

Detectam
substncias que
possuam
determinado
elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas

Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU


TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste.
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):
ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):
Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por
eluatos altamente eletroflicos.
DETECTOR TERMOINICOS (DNP OU NPD): Modificao
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfcie de silicato de rubdio onde se formam ons de
molculas com N e P.

Cromatografia Gasosa
Detectores Limites de deteco

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU


TCD): Universal. Observa-se para qualquer substncia eluda.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade at dezenas de g (104).

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):

Quase-universal. Detecta qualquer substncia que contenha


ligaes C-H. No responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halognio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade at mg (10 7 108).

DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):

Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgnicos, aldedos


conjugados, nitrilas, nitratos e organometlicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade at ng. (104)
DETECTOR TERMOINICO (DNP OU NPD): Especfico.
Responde a compostos orgnicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade at ng. (103 - 105)

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico. Um dos


detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa o
espectrmetro de massas. Observa-se para qualquer substncia
eluda um sinal, mesmo que complexo, no espectrmetro de massa.
seletivo ou especfico quando monitora-se um fragmento de
determinada razo m/z.

Deteco
TIC
Universal
Similar a DCT

SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.

CONTAGENS

Cromatograma de ons totais:


TIM (monitoramento de ons
totais) ou TIC
( cromatograma de ons
totais)
Em cada posio do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.

CONTAGENS

MASSA / CARGA

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.

CONTAGENS

Cromatograma de ons
selecionados: SIM
Em cada posio do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada.
CONTAGENS

Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
cego para os
demais.

MASSA / CARGA

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.

EM

CG

Coluna
Capilar

Cmara
de Ionizao

Vcuo
Separador Molecular
O gs de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vcuo.

Interface Capilar Direta


Com colunas capilares a
vazo baixa de gs de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vcuo.

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o

TEMPO DE RETENO AJUSTADO, tR:


tR

SINAL

tR = tR tM
t
M

TEMPO

tR = Tempo de Reteno (tempo


decorrido entre a injeo e o pice
do pico cromatogrfico)
tM = Tempo de Reteno do
Composto No-Retido (tempo
mnimo para um composto que no
interaja com a FE atravesse a
coluna)
tR = Tempo de Reteno Ajustado
(tempo mdio que as molculas do
analito passam sorvidas na FE)

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m
Detector FID: 250 C
Injetor com diviso de fluxo 1:25: 250 C
Volume injetado: 1 L

Mistura de benzeno, n-propanona,


n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.

Como se explica esta


ordem de eluio?

1. A n-propanona elui primeiro


devido sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor ).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenas de polaridade
no so elevadas, a volatilidade
se torna o principal parmetro
que define a ordem de eluio.

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
O parmetro diretamente relacionado quantidade de analito :

SINAL

Altura da banda cromatogrfica: no recomendado, pois


a banda necessita ser perfeitamente simtrica.
rea da banda cromatogrfica.

rea

TEMPO

Altura

Cromatografia Gasosa

amostra

rea

Anlise quantitativa

Concentrao

tempo

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa

MASSA

O fim da zona de linearidade pode


ser detectado quando a razo
(rea / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinao da reta na
regio linear:

1,05 S

REA / MASSA

REA

A partir de certo
ponto o sinal no
aumenta mais
linearmente

0,95 S
MASSA

Cromatografia Gasosa
concentrao
na amostra
amostra

rea

Anlise quantitativa

Concentrao Adicionada

tempo

Cromatografia Lquida
Cromatografia em fase lquida

Cromatografia Lquida - CLAE


Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um lquido
ela deve dissolver-se nesse lquido.

Lquidos e slidos, inicos ou covalentes com massa molar


de 32 at 4000000.

DE FORMA GERAL:
CL aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes sejam solveis na FM. No h limitao de
volatilidade ou de estabilidade trmica.

Cromatografia Lquida
Aumento de polaridade

Insolvel em gua

Solvel em gua

Apolar
Polar no inico

Tipos e

Partio

Aplicaes da

102

Massa molecular

Cromatografia
Lquida

Inico

103

Partio
Adsoro em fase
reversa

Partio
em fase
normal

Troca
inica

104

105

106

Permeao
em gel

Excluso

Filtrao
em gel

Cromatografia Lquida
Componentes tpicos - CLAE

Cromatografia Lquida
Esquema de um equipamento para CLAE

Cromatografia Lquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 Gerao de presses at 6.000 psi
2 Sada com ausncia de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 Componentes resistentes corroso

Bomba recproca (tambm so chamadas de


bombas de pisto ou de diafragma)

Cromatografia Lquida
Sistemas de injeo de amostras

Suportam presses de at 7.000 psi


Volumes tpicos: 5 a 500 L
Microamostragem: 0,5 a 5 L

Cromatografia Lquida
Fase mvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separao.
Eluio isocrtica:

Quando a separao feita utilizando um nico solvente de


composio constante.

Eluio com gradiente:

So utilizados dois ou trs sistemas de solventes que


diferem bastante entre si em polaridade.
Depois que a eluio comea, a razo entre os solventes
variada de modo programado, de forma contnua ou em
passos.

A eluio com gradiente produz efeitos similares aos


produzidos pela programao de temperatura na CG.

Cromatografia Lquida
Eluio com gradiente

Coluna C18, 5 m, fase reversa


Detector fluorescncia:
excit. 334 nm emis. 425 nm

CARACTERSTICAS DAS FASES MVEIS EM


CLAE
VISCOSIDADE
COMPATIBILIDADE COM TIPO DE DETECTOR
UTILIZADO
POLARIDADE DA FASE MVEL
MISCIBILIDADE

DICAS E CUIDADOS COM AS FASES


MVEIS

A fase mvel deve ser de alta pureza, como um solvente de


grau cromatogrfico, permitindo realizar anlises de alta
sensibilidade com detectores por fluorescncia ou por
absorbncia no ultravioleta, onde as impurezas da fase
mvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do
detector para os componentes da amostra.
No preparo da fase mvel deve-se filtrar o solvente
(trabalhar com filtro Millipore) e desgaseific-lo. Deixar o
solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no
mnimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a soluo a
ser preparada. No caso de solvente orgnico com gua, esse
tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de
gua e lcool, que exotrmica, deve-se efetuar a mistura e
depois desgaseific-la. Em mistura de acetonitrila e gua a
desgaseificao deve ser feita em temperatura baixa devido
grande volatilidade da acetonotrila.

Quando se utilizar cromatografia lquido-lquido, a fase


mvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar
isto, satura-se a fase mvel com a fase estacionaria
utilizando-se para isso uma pr-coluna contendo uma
alta concentrado da mesma fase estacionaria.
Ao se trabalhar com gua, tomar todos os cuidados
para que no se forme fungo dentro da coluna. Lavar
sempre o sistema abundantemente e passar um agente
de esterilizao (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para
anlise de acares utilizar gua ligeiramente
acidificada.
O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com
soluo tampo. Nesse caso uma ateno a mais deve
ser dada. No deixar o sistema parado quando se
trabalha com tampo, pois pode cristalizar sal na
regio do pisto da bomba. Ao se reiniciar o trabalho,
esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pisto

Cromatografia Lquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente so
construdas de ao inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
ltimos so restritos a presses
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionria. Preos variam de 200 a 500 dlares.

Cromatografia Lquida
Colunas para CLAE
Remoo de material particulado

Pr-coluna

Contaminantes do solvente
Contaminantes da amostra
Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida til da coluna


COLUNAS TPICAS
Material: ao inox
Comprimento: 10 a 30 cm
Dimetro: 4 a 10 mm
FE: Partculas de 5 a 10 m
Eficincia: 40 mil a 60 mil
pratos/metro

Cromatografia Lquida
Separao isocrtica de alta velocidade
Coluna de alta
velocidade e
alta eficincia

- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 m

100.000 pratos/metro

FM: 4,1% EtAc em n-Hexano


1 p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato

Cromatografia Lquida
Fase estacionria para CLAE
Basicamente so dois tipos de FE:
Pelicular:
Consiste de leitos de polmero ou vidro no-poroso,
esfrico, com dimetros tpicos da ordem de 30 a 40 m,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
Slica (ou slica modificada)
Alumina
Resina de poliestireno-divinil-benzeno
Resina trocadora de ons
Partcula porosa:
Consiste de micropartculas porosas com dimetros de 3
a 10 m. As partculas so constitudas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.

A superfcie de slica, que o suporte mais popular, pode ser


modificada por um destes caminhos, entre outros:
a) Formao do ster silicato (Si-O-R) por reao do grupo
silanol com um lcool:
Si-OH + ROH Si-O-R + H2O
b) Formao de ligao siloxano (Si-O-SiR3) por reao do
grupo silanol com um organoclorosilano:
Si-OH + R3SiCl Si-O-SiR3 + HCl
c) Formao da ligao slicio-carbono pelo tratamento do
grupo silanol com cloreto de tionila, para produzir o cloreto,
que, em seguida, reage com um composto organometlico para
produzir um grupo orgnico ligado diretamente superfcie
da slica:
Si-OH + SOCl Si-Cl + SO2 + HCl
Si-Cl + RLi Si-R + LiCl

Slica

Reao de
Silanizao

Octadecilsilano
Preparao da Fase Ligada

M+ + R-SO3- Na+ Na+ + R-SO3-M+


Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca inica,
so:
-SO3- -trocadores fortes de ctions
-CO2- -trocadores fracos de ctions
-NR3+ -trocadores fortes de nions

TCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS


O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a
seco ou usando uma suspenso da fase estacionria em
um solvente apropriado. Sendo que as pequenas
partculas, durante o enchimento a seco com vibrao,
tendem a formar aglomerados, produzindo um acumulo
das partculas maiores perto da parede e das menores no
centro da coluna, o mtodo de enchimento por suspenso
com alta presso e preferido para rechear colunas com
partculas de dimetro menor do que 25 m.

Bombas Recprocas
Escoam volumes constantes de forma no contnua - pulsante.
Sistema de Operao
Atravs do movimento de um pisto (movimentado por um eixo
excntrico) e atravs de um sistema de vlvulas que
alternadamente se abrem e fecham, onde se enche e esvazia uma
pequena cmara, de modo alternativo.

Volume interno de 100-200 L.

Os pistes so de safira, que confere resistncia ao ataque da


maioria dos solventes utilizados em CLAE, precaes soluo
tampo;
O selo do pisto um disco de teflon fixo no interior do corpo da
bomba, feito de ao inoxidvel quimicamente resistente.
Selos com o tempo de uso comeam a apresentar vazamentos na
bomba por isso devem ser substitudos;
As bolas das vlvulas so de rubi aparada em base de safira,
formando um selo.
A presso dentro do reservatrio da bomba a responsvel pela
abertura e o fechamento do selo.

Bombas Recpocras : Pisto Simples ou Duplo

Pisto Simples
Vantagens
Geram altas presses e vazes de volume constante;
Compatibilidade com eluio por gradiente e reservatrio sem
limite de volume (alimentada continuamente pela FM);
Desvantagens
Sofre cavitao (formao de bolhas durante o movimento dos
pistes), devido a compressibilidade dos lquidos;
Vazo pulsante e no de forma contnua e uniforme decorrente do
movimento de ida e volta do pisto;
Perda na eficincia da coluna e instabilidade do detector deve
usar um amortecedor de pulso.

Pisto Duplo
Dois pistes so acionados por um mesmo eixo excntrico, de
forma que, quando um pisto succiona a FM, o outro expulsa o
lquido para fora da bomba.

Vazo de ambos os pistes, j quase livre de pulsao,


encaminhada coluna por uma via comum.
Sistema de duplo pisto tem todas as vantagens da pisto simples,
alm da vantagem adicional da grande diminuio do problema de
pulsao.

Bombas do Tipo Seringa


Chamadas tambm de mbolo ou de deslocamento contnuo.
Possuem um mbolo ou pisto que deslocado de forma contnua
e uniforme por um motor de preciso, comprimindo o lquido
contido em uma cmara de volume constante.
Vantagens apresenta altas presses, no apresentam pulsao e
possuem fluxo constante da FM.
Desvantagem o reservatrio de solvente limitado, o que
dificulta o preenchimento e a mudana da FM, pois implica parar
o sistema e despressurizar.
Poucos instrumentos empregam esse tipo de bomba, devido ao
alto custo e as vantagens das bombas recprocas.

Bombas Pneumticas
Esta bomba tem um pisto que se movimenta pela ao de agente
pneumtico.
O reservatrio da bomba cheio pela fora do ar comprimido,
que desloca o pisto ou diafragma.
As vazes obtidas so livres de pulsaes e de presso
constante, isso significa que, se a resistncia presso da coluna
muda, a vazo tambm muda.
As desvantagens deste sistema so:
- Instabilidade na velocidade do fluxo;
- Mudanas no tempo de reteno, dificultando a interpretao
dos resultados;
- Capacidade limitada do volume total que pode ser bombeado.

Cromatografia Lquida
Detectores

As caractersticas desejveis para os detectores


para CLAE no so diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:

Propriedades universais (ndice de refrao, densidade ou


constante dieltrica).
Propriedades do soluto (absorbncia, fluorescncia, etc).

Caractersticas ideais:

1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.


2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por vrias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazo.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.No destrutivo.
8.Volume interno mnimo e compatvel com a vazo e com a presso .

Cromatografia Lquida
Detectores
Absorbncia
UV/Vis S: 10-9 g/mL FL: 105
IV

Fluorescncia S: 10-9 a 10-12 g/mL FL: 103


ndice de refrao (universal)
S: 10-7 g/mL FL: 104

Cromatografia Lquida
Detectores
Eletroqumicos: existem vrios tipos disponveis atualmente.
Embora no sejam to explorados quanto os detectores
pticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
Amperomtricos
Coulomtricos
Condutomtricos S: 10-8 g/mL FL: 104
Polarogrficos S: 10-12 g/mL FL: 106

Cromatografia Lquida
Detectores
Espectrometria de massa - universal
Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrmetro de massa
potencializa a tcnica de separao e quantificao
Um grande problema o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vcuo na EM.
Interface CL-EM

Cromatografia Lquida
Detectores
Espectrometria de massa
SIM
CONTAGENS

CONTAGENS

TIC

CONTAGENS

CONTAGENS

MASSA / CARGA

MASSA / CARGA

TEMPO
TEMPO

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Ao contrrio da CG, onde a FM se comporta como
um gs ideal e no contribui para o processo de
separao, a FM lquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos mtodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
PARTIO: lquido-lquido e fase ligada. A diferena entre
elas consiste em como a FE mantida nas partculas do
suporte do empacotamento Adsoro e ligao qumica.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. gua)
FM apolar (ex. hexano ou ter isoproplico)
O componente menos polar eludo primeiro por ser o
mais solvel na fase mvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. gua, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase mvel aumenta o tempo de eluio.

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
provvel que de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Campo
Farmacutico
Bioqumico
Produtos alimentcios
Produtos qumicos
Poluentes
Qumica forense
Clnica mdica

Misturas tpicas
Antibiticos, sedativos, esterides,
analgsicos
Aminocidos, protenas, carboidratos, lipdios
Adoantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Aromticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Pesticidas, herbicidas, fenis, PCB (bifenilas
policloradas)
Drogas txicas, venenos, lcool no sangue,
narcticos
cidos de blis, metablitos de drogas,
extratos de urina, estrgenos

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
ADSORO: lquido-slido. FE slica ou alumina. a forma
clssica da CL introduzida no incio do sculo 20. Sofreu
adaptaes e tornou-se o mais importante dos mtodos de
HPLC.
TROCA INICA: lquido-slido. FE resina com capacidade
de troca inica.
EXCLUSO: lquido-gel. FE gel. Um material polimrico,
hidrofbicos ou hidroflicos, com muitas ligaes cruzadas,
so capazes de promover a separao de acordo com os
tamanhos das molculas EXCLUSO DE TAMANHO. Se
o material reticulado for uma resina de troca inica, tem-se
a cromatografia de EXCLUSO DE ONS.

Tabela 1 -Comparao entre as caractersticas da CG e CLAE

Fator

CG

CLAE

Requisitos para
amostra

Amostra ou derivado
voltil, termicamente
estvel .
Gases, lquidos e
slidos; MM 2 a
1.200 g mol-1

Amostra solvel na fase


mvel.

10-10 g a 10-13 g

10-10 g a 10-12 g

Tempo de Anlise

Minutos at uma hora

Minutos at poucas horas

Nmeros de pratos
por coluna

2.000 (recheadas)

5.000 a 25.000
(recheadas)

Tipos de amostra

Quantidades
mnimas detectveis

50.000 (capilares)

Lquidos e slidos, inicos


ou covalentes; MM 32 a
4.000.000 g mol-1

Fator

CG

CLAE

Capacidade
Preparativa

Pobre, necessitando
de mltiplas injees

Boa, com facilidade de


coleta e capacidade de
mecanizao;

Capacidade Analtica

Excelente, separao
de amostra com at
200 componentes

Excelente, separao com


at 100 componentes eum
uma amostra

Grau de dificuldade
e manuseio do
equipamento

Relativamente fcil

Requer maior tempo de


treinamento, devido ao
conjunto de diferentes
modalidades.

Alm desses parmetros;

CLAE - 2 fases cromatogrficas (FE e FM) e CG apenas (FE);


Possui maior variedade de FE que atuam em diversos
mecanismos de separao;
Permite a separao de compostos termicamente instveis;

CLAE e CG

no so Competitivas

Duas tcnicas se complementam e analisam diferentes tipos


de amostras .

Vantagens da CLAE
Determinao de molculas de ampla faixa de massas molares;
Sensibilidade variando de nanogramas a picogramas;
Raramente necessita de derivatizao;
Pode analisar amostras com n compostos diferentes;
Combinao de velocidade, reprodutibilidade e sensibilidade.

Tabela 2- Vantagens e limitaes da CLAE

Aplicaes
Anlise alimentos, medicamentos, herbicidas, combustveis, sangue,
urina, plantas, etc, com o mnimo de purificao e modificao;
Geralmente o nico procedimento de amostragem a ultrafiltrao;
Pr-concentrao da amostra;