UNIVERSIDAD DEL TOIMA

FAC. INGENIERIA AGRONMICA

GENERALIDADES DE CULTIVOS IN-VITRO

ARMANDO EMILIO REY TORRES
Ingeniero Agrnomo MSc

Pierik (1987) define cultivo in vitro de plantas superiores como:

El cultivo en medio nutritivo, bajo condiciones

estriles, de plantas, semillas, embriones, rganos,
explantos, tejidos, clulas y protoplastos de plantas
superiores.

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro

de tejidos vegetales,
Es una tcnica de reproduccin en condiciones
totalmente aspticas, en la que a partir de un
pequeo segmento inicial de tejido es posible
regenerar en poco tiempo miles de plantas
genticamente iguales a la planta madre,
cuando a este tejido le es aplicado un estmulo
por medio de variables fsicas y qumicas
controladas en un medio de cultivo

CULTIVO DE TEJIDOS

VENTAJAS
Propagacin de grandes volmenes de plantas

en poco tiempo; en espacios reducidos.

Obtencin de plantas libres de patgenos;
Plantas homocigotas,
Produccin de plantas en peligro de extincin,
En estudios de ingeniera gentica, etc.

HISTORIA
A Morgan (1901) se le atribuye el trmino

de la totipotencialidad celular.
Haberlandt (1902) con la idea de la

totipotencialidad celular desarrolla el

primer cultivo in vitro de tejidos vegetales.
White (1932) logra el primer cultivo in

vitro estable utilizando en sus

experimentos pices de races de jitomate.

En 1934 Gautheret logra proliferacin celular in vitro en

tejidos cambiales provenientes de plantas adultas.

En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de

zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi

simultneamente la formacin de una masa de clulas
parenquimatosas (callo) a partir de los explantes
(tejidos) utilizados en sus experimentos.
Un factor importante en el desarrollo de las tcnicas de

cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los

reguladores de crecimiento.
Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia

presente en el agua de coco que estimulaba la divisin

celular (efecto citocinnico). Cuando el agua de coco se
combinaba con 2,4-D, tenia un efecto positivo en el
desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y
Steward 1948, 1952).

REA DE DESINFECCIN

LAVAPLATOS
MESONES
AUTOCLAVE
ALCOHOL
HIPOCLORITO
JABN
AGUA
VIDRIERIA

ESTERILIZACIN DEL MATERIAL VEGETAL

Obtener material vegetal libre de microorganimos es la esterilizacin de la superficie de
ste.

Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras partculas

(opcional).
Eliminacin de las partes muertas e infectadas de la planta.
Introduccin de la porcin de planta en alcohol diluido al 80% durante unos segundos.
Sumergir la planta en una solucin de hipoclorito de sodio (por ejemplo al 1%) con un

agente humectante (por ejemplo Tween 20 o Tween 80), durante 10-30 minutos.
Enjuague del material con agua estril para eliminar la solucin de hipoclorito de

sodio.
El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, ( tres veces sucesivas de

unos 2 minutos cada una).

El proceso de esterilizacin presenta, dos

problemas:
la capacidad de los agentes esterilizantes

para daar los tejidos vegetales y

la presencia de microorganismos en el

interior de dichos tejidos.

El hipoclorito de calcio en polvo en una concentracin de 35100 g/l se puede usar. El material vegetal debe permanecer
sumergido entre 5-30 minutos y ser enjuagado con agua
estril al finalizar.

LIMPIEZA Y SIEMBRA
Una vez escogida la planta madre, se extraern los fragmentos a

partir de los cuales se obtendrn los explantes.

Antes de extraer los explantes se har una desinfeccin de los

fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes

externos.
Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en

condiciones de asepsia.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajar en cabinas de flujo

laminar) se extraen los explantos del material vegetal y se colocan

en cultivo en un medio de iniciacin dentro de un tubo de cultivo,
para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.

El cultivo in vitro de plantas superiores es una

tcnica que exige un control absoluto del

ambiente, tanto fsico como qumico, en el
que se sita al explante.
Conviene, por tanto, conocer cuales son los

principales factores que conforman el

ambiente del explante y que debern ser
controlados

AMBIENTE QUMICO
COMPOSICIN DEL MEDIO
pH
AMBIENTE FSICO
TEMPERATURA
LUZ Y FOTOPERODO

ESTERILIZACIN DE VIDRIERIA
Y MEDIOS
La esterilizacin, tanto del material y medios

frescos, como de los medios ya usados que haya

sufrido contaminacin, es un proceso esencial en
todo laboratorio de cultivo in vitro.
Esta esterilizacin suele efectuarse con calor

hmedo en autoclaves.
En situaciones especiales, como en el caso de que

algn componente del medio sea termolbil, puede

usarse un sistema de esterilizacin por filtracin.

REA DE PREPARACIN DE MEDIOS

SALES
VITAMINAS
SACAROSA
REGULADORES DE CRECIMIENTO
SUSTANCIAS ORGNICAS
AGUA
GELEFICANTES
BALANZA
PEACHIMETRO
DES-IONIZADOR
DESTILADOR
AGITADOR
ESTUFA
NEVERA

REA DE SIEMBRA
CAMARA DE FLUJO LAMINAR
REA ESTERIL
RESTRINGIDA

CAMARA DE FLUJO LAMINAR

Segn el grado de sofisticacin de la cmara, puede

disponer de elementos accesorios como son:
fuente de luz,
lampara de esterilizacin por U.V.,
pilotos indicadores de funcionamiento diversos,
contador de horas de funcionamiento,
indicador de presin interior, entre otros.
Existen dos tipos de cmaras de flujo laminar segn sea
la forma en la que se hace circular el aire:
cmaras de flujo horizontal
cmaras de flujo vertical.

LA CMARA DE FLUJO LAMINAR

condiciones de esterilidad total para evitar la contaminacin de

los cultivos.
Para disponer de una superficie de trabajo estril que no ponga en

peligro la esterilidad de los cultivos

Una cmara de flujo laminar es un receptculo en forma

generalmente prismtica con una nica cara libre (la frontal) que
da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo.
Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cmara de

flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presin
interior sea ligeramente superior a la presion exterior, con lo cual
el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revs.

AUTOCLAVE
un autoclave es un equipo en el que se
consigue exponer el material a esterilizar a
temperaturas superiores a la de ebullicin del
agua, gracias a aumentar la presin.

FUNCIONAMIENTO
El proceso de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fase:
FASE DE PURGADO. A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del

caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la

vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la
temperatura de esterilizacin.
FASE DE ESTERILIZACIN. Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada

la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso

de esterilizacin.
FASE DE DESCARGA. Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar

la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y

temperatura del caldern empiezan a bajar poco a poco.

CMARAS DE CULTIVO O REA

DE CRECIMIENTO
Una cmara de cultivo es un receptculo diseado

para permitir el control de algunas variables del

ambiente fsico. Habitualmente se pueden controlar la
temperatura, la iluminacin y el fotoperodo y en
algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire
y su composicin.
Existen muchos modelos de cmaras de cultivo, en

unos casos se trata de espacios reducidos,

frecuentemente mviles, mientras que en otros casos
son verdaderos recintos acondicionados para permitir
el control del ambiente interior.

LUZ
Los aspectos relacionados con la luz que son

importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: LA IRRADIACIN
La calidad de la luz: EL ESPECTRO
La alternancia de los ciclos de luz con los de

oscuridad: EL FOTOPERODO

LA IRRADIACIN
La cantidad de luz que incide sobre las superficies
fotosintticas de las plantas determinar en gran medida la
capacidad fotosinttica de stas.
expresndola en lux ( unidad definida en trminos de

percepcin del ojo humano);

bien midiendo la irradiancia, es decir, la energa radiante que

llega a una superficie dada en un intervalo de tiempo.

longitudes de onda comprendidas entre 400 y 700 nm,
obtenemos una medida de la radiacin fotosintticamente
activa (PAR)

Las necesidades de luz de los cultivos in vitro

son inferiores a las de la planta in vivo, dado

que el medio de cultivo contiene cantidades
importantes de sacarosa, los cultivos in vitro
se comportan slo parcialmente de forma
autotrfica.
La irradiacin habitual en el campo (a plena

insolacin puede llegar a 450 W m-2) es nociva

en condiciones in vitro. Es habitual usar
irradiaciones mucho menores (un 10% o
incluso menos del valor de plena insolacin)

Control del fotoperiodo

El nmero de horas de luz diarias que recibe el cultivo

(fotoperiodo).
La regulacin del fotoperiodo se consigue mediante un

programador (analgico o digital)

el mejor fotoperiodo in vivo ser tambin el mejor

fotoperiodo in vitro.

MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es la combinacin slida

o lquida de nutrientes y agua.

Sales inorgnicas,
carbohidratos
vitaminas y aminocidos.
regulador de crecimiento
Sustancias orgnicas
Geleficantes

Sustancias orgnicas
Azcares
Aminocidos
Auxinas
Citoquininas
Giberelinas
Acido abcsico

Macro Micro
elementos
N

P
K
Ca
Mg
S
Fe
Zn
B
Mn
Cu
Ni
Co
Al
Mo
I

Mezclas de sustancias
Extracto de levadura
Leche de coco
Extractos vegetales
Hidrolizados de casena
Peptona y triptona

Los requerimientos nutritivos (especie, parte de la planta,

objetivo perseguido)
El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado,

particularmente si el objetivo es regenerar plantas;

existen numerosas variaciones comerciales de este medio.

El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios

derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de clulas y
protoplastos, y tambin es utilizado eficazmente en
regeneracin de plantas.
La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor

concentracin de nitratos en B5.

El medio WPM (1980) de baja concentracin de sales est

especialmente indicado para especies leosas.

Qu medio elegir?
De Fossard (1976) sugiri un experimento de amplio espectro

utilizando 4 grupos de los componentes ms frecuentemente vitales

en el medio nutritivo:
Sacarosa: 1 - 2 - 4%
Macro-sales (de acuerdo con Murashige y Skoog,1962): Diluida 1/4 -

1/2 - 1/1
Auxina (p.e., IBA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l -1
Citoquinina (p.e., BA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l

-1

Las combinaciones de las tres concentraciones de cada grupo

producen un total de 34 = 81 medios diferentes, de los que se elige

el ptimo

Diagrama de flujo del proceso de preparacin

de un medio de cultivo a partir de soluciones
stock.

Sustancias que pueden formar parte de los medios

nutritivos, para inducir el crecimiento y desarrollo

(Pierik, 1987, modificado)

Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in

vitro ptimo varan con la especie, e incluso son

especficos de acuerdo a la parte de la planta que se
est cultivando y a la respuesta que se desea obtener.

Debido a estas necesidades especficas se han

desarrollado muchas formulaciones para los medios

de cultivo .

El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962) = es regenerar

plantas; existen numerosas variaciones comerciales de
este medio.
El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios
derivados = Cultivo de clulas y protoplastos, y tambin
es utilizado eficazmente en regeneracin de plantas.
La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la
menor concentracin de nitratos en B5.
El medio WPM (1980) de baja concentracin de sales est
especialmente indicado para especies leosas.

pH
Despus de aadir todos sus componentes, se procede a ajustar el
pH final al valor deseado, aadiendo OHNa 0.1 N o HCl 0.1N al
medio. Optimo . 5.2 y 5.8.
Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificacin de los agentes

gelificantes aadidos a los medios slidos

Si la evolucin del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede

producir su licuacin.

El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del

medio de cultivo

El valor del pH puede afectar a la absorcin de determinados nutrientes por

parte del explanto (p.e. la absorcin de iones NO3-aumenta con la acidez

del medio)

El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como

consecuencia a la actividad de muchos enzimas

Temperatura
La temperatura a la que est expuesto el explanto cultivado in
vitro afecta a la mayora de procesos fisiolgicos y por
consiguiente es un factor fundamental a controlar.
cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que

se produce el crecimiento ptimo. 20 y 280C.

Este intervalo puede variar en

Genotipo
Organo del que se ha obtenido el explanto
poca del ao
Edad de la planta madre
Fofotoperodo, etc

LA PLANTA MADRE, MATERIAL VEGETAL

Para poder establecer el cultivo en condiciones de

asepsia, se deben obtener explantes con un nivel

nutricional y un grado de desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable

mantener a las plantas madre un perodo de tiempo

que puede oscilar entre unas semanas o varios
meses, en un invernadero, en que se va a intentar
cultivar la planta en condiciones sanitarias ptimas
y con un control de la nutricin, del fotoperodo y de
la irradiancion recibida.

EXPLANTO
La porcin vegetal que se introduce in vitro

se denomina explanto.
El explanto es un meristema que definimos

como una porcin de la planta en activa

divisin celular.
Esta porciones del vegetal que se utilizan

como material de partida en programas de

saneamiento se encuentran carentes de virus.

CULTIVO DE MERISTEMOS
Meristemo apical.
Eliminacin de infecciones virales
Conservacin de germoplasma.

Carece de tejidos vasculares,

Mayor velocidad de crecimiento

La separacin del meristema del resto de la

planta se efecta con ayuda de lupa y

utilizando pinzas y bistures previamente
esterilizados,
Se transporta aspticamnte al recipiente que

contiene el medio nutritivo esterilizado.

Este medio de cultivo ser el responsable del

crecimiento de meristemo y de la formacin

de nuevos brotes que se multiplicara.

MERISTEMO

CULTIVO DE
MERISTEMOS
Meristemos apicales tienen mayor
probabilidad de estar libres de virus que los
meristemos axilares, y
Si los meristemos provienen de una planta en
plena actividad hay mayor probabilidad de
obtener plantas libres de virus.

Los meristemos se cultivan generalmente sobre medio slido,

El pH normalmente se sita entre 5,4-6,0.
El contenido de sacarosa es de un 2-4%.
vitamina B1, piridoxina, cido nicotnico y cido pantotnico.
Los reguladores (0,1-0,5 mg l-1); son auxinas y citoquininas

para promover la divisin celular;

Los meristemos se ponen bajo luz fluorescente (en general de

1,000 a 3,000 lux)

Fotoperodo de 14-16 horas
Temperatura de 23-25 oC.

ENDURECIMIENTO
ESTADO DE DESARROLLO
ESTRUCTURA
SUSTRATO
FOTOPERIODO
TEMPERATURA
HUMEDAD
SANIDAD
TIEMPO
TRANSPLANTE

GRACIAS POR SU
ATENCIN