Universidad Nacional Experimental del Tchira

Decanato de Investigacin
Coordinacin de Ciencias Exactas y Naturales
Laboratorio de Investigacin en Biotecnologa y Qumica de
Polmeros

Cuantificacin de Protenas Bradford

Ruiz Agelvis, Claudia Jeannette

Introduccin
Purificacin de protenas
Cuantificacin de protenas Rendimientos
Balance de masa
Determinacin de Actividad
especfica

Ensayos espectrofotomtricos

Colorimetra Absorbancia UV Fluorescencia

Ventajas:
- Alto rendimiento
- Reactivos econmicos
- Equipo sencillo

No
requieren
digestin
enzimtica/qumica
o
separacin previa al anlisis

Introduccin
Los ensayos espectrofotomtricos requieren una protena estndar
apropiada para realizar una buena estimacin de la concentracin
Criterios para seleccionar un ensayo

Volumen
de
muestra

Recuperaci
n de la
muestra

Rendimiento

Robustez

Modificaci
n qumica

Sensibilidad

Mtodos
no
destructiv
os

Mltiples
muestra
s

Repetibilidad

Modificaci
n
covalente

Varios mtodos dependen de la composicin de la protena:

- Contenido de aminocidos
- Material unido covalentemente
- Conformacin de la protena

Figure 8.1 Flow chart for the selection of assays for quantitation or proteins in common
protein purification procedures.

Noble y Bailey (2009)

Espectroscopa de absorcin UV
Absorbancia a 280 nm (Rango: 20-3000 g)
Espectro de absorcin a 280 nm por:
Cubetas de cuarzo

Tirosin
a

Triptfan
o

Ley Beer-Lambert
A = amcl
am = Coeficiente de extincin
molar
c = concentracin del analito
l = longitud de la trayectoria

Espectrofotmetro

Espectroscopa de absorcin UV
Absorbancia a 205 nm (Rango: 1
-100 g)
Absorbancia mxima por debajo de 210
nm
Ms sensible que absorbancia a 280 nm

Coeficiente de extincin de protenas a 205 nm para 1 mg/mL de solucin = 30 - 35

Toma en cuenta
variaciones en contenido
de Trp y Tyr

Coeficiente de extincin expresado en: M-1 cm-1

Mtodos colorimtricos
Ventajas:
- Econmicos
- Conservacin por largos perodos de
tiempo
- Repetibilidad
- Adaptables a microplacas

Protenas estndar empleadas

Gamma globulina bovina

BSA

Inmunoglobulinas

Reaccin Biuret
Complejo: iones cpricos + protena (enlace peptdico)

Caractersticas:
- Medio alcalino
- Independiente de la composicin de la protena
- Poco sensible

Agentes que interfieren:

-

Buffer Tris
Iones amonio
Sacarosa
Aminas primarias
Glicerol

Lowry (Rango: 5-100 g)

Paso
s

Reduccin de
reactivo FolinCiocalteu

Reduccin
de Cu2+ a
Cu+

Desarrollo del color:

Tirosina

Triptfano
Cistina

Cistena

Histidina

Lowry (Rango: 5-100 g)

Reactivos:
- Folin-Ciocalteu: mezclado con agua
- Sulfato de cobre: CuSO4 5H2O + tartrato de sodio en agua. Mezclado
con carbonato de sodio en agua.
- Cobre alcalino: 1 parte de sulfato de cobre + 1 parte de SDS 5% + 2
partes de NaOH 3,2%

Procedimiento:
Muestra o
estndar +
Cobre
alcalino

FolinCiocalteu.
Vrtex

Incubar 10
min

Absorbancia 750
nm
Vara respecto a la composicin de la protena:
Contenido de tirosina y triptfano

Incubar 30
min. Vrtex

Agentes que interfieren:

Bffers con nitrgeno

cido bicinconnico BCA (Rango 0,2-50 g)

Reemplaza reactivo Folin - Ciocalteu por cido bicinconnico

Residuos que contribuyen a reduccin de Cu2+

Cistina

Cistena

Triptfano

Tirosina

Chen et al. (2012

cido bicinconnico BCA (Rango 0,2-50 ug)

Reactivos:
Reactivo A: Bicinconinato de sodio + Na2CO3 + tartrato de sodio + NaOH +
NaHCO3
Reactivo B: CuSO4 5H2O en agua
Solucin de trabajo: 100 partes de reactivo A y 2 partes de reactivo B

Procedimiento

Protena +
Solucin de
trabajo

Incubacin a
37 60 C /
30 min.

Absorbancia
a 562 nm

Agentes que interfieren:

Caractersticas:
- Medio alcalino
- Depende de la composicin proteica
- Depende de la temperatura, tiempo y pH - Mide protenas insolubles
-

EDTA
Glucosa, fructosa, lactosa
H2O2
Fosfolpidos
Catecolaminas
Penicilinas, paracetamol
Ditiotreitol, glutatin, 2-mercaptoetanol
Tween

Derivatizacin de aminas (Rango: 0,05-25 g)

Caractersticas:
-

Emplea sondas fluorescentes

Cuantifica aminocidos (AAA), protenas y pptidos con Lisina o Nterminal libre
Incremento de fluorescencia a mayor concentracin de protena

Colorantes

CBQCA
Fluorescamina

3(4carboxibenzoil)quinolina2-carboxialdehido

Derivatizacin de aminas (Rango: 0,05-25 g)

Derivatizacin de aminas (Rango: 0,05-25 g)

Reactivos:
Stock OPA: o-phthalaldehido en metanol diluido+cido brico +
polioxietileno lauril ter

Procedimiento
Stock OPA + 2mercaptoetanol.
Incubar 30 min

Leer fluorescencia a
excitacin 340 nm y
emisin de 440 a 455
nm

Ajustar protena a pH 8
10,5. Mezclar con stock
OPA

Aadir NaOH. Mezclar

Limitaciones:
-

Variabilidad protena a protena segn nmero de residuos de lisina.

Requiere estndar especfico
Agentes que interfieren: bffers con glicina y aminas, iones amonio, tioles
Reproducibilidad dependiente de pH

Bradford
Azul de Coomassie (CBB) Bradford (1-50 g)
Unin a:

Arginina

Familia del magenta

Medio cido

Histidina

Triptfano

Fenilalanina

Tirosina

Depende de la composicin de la
protena, necesita estndar
apropiado

Bradford
Mecanismo de interaccin:
-

Sedmak y y Grossberg (1977): unin colorante-protena mediada por

interaccin con grupos amino protonados.
de Moreno et al. (1986): importancia de grupos sulfnicos. Unin a
lisina y arginina.
Congdon et al. (1993): slo importan lisina y arginina.
Chial y Splittgerber (1993): slo la forma ionizada del colorante (azul)
se une a la protena.
Tal et al. (1985): tambin hay interacciones hidrofbicas

Forma azul (ionizada) del azul de Coomassie G-250 (Chial et al. 1993)

Bradford
Reactivo:
100 mg de CBB G-250 en 50 mL de etanol 95% + 100 mL de cido
fosfrico 85%. con agitacin constante. Diluir a 1 L en agua.

Procedimiento:
Preparar estndars
(100 1500 ug/mL)
y muestras
problema

Colocar en
cubetas

Graficar
los
datos*

Aadir reactivo
Bradford,
mezclar e
incubar 10 min

Medir
absorbancia
a 450 y 595
nm

*Grfico de los datos:

-Sedmak y Grossberg (1977): Radio de absorbancia a 620 y 465 nm.
-Zor y Selinger (1996): Radio de absorbancias a 590 y 450 nm. Mayor
sensibilidad.

Bradford

Bradford (1976)
Protocolo propuesto para eliminar las limitaciones de los
mtodos disponibles para ese entonces

Lowry

Interferencia
por

Reaccin Biuret

Interferencia
por

Ion potasio
Ion
magnesio
EDTA
Tris
Tioles
Carbohidrat
os

Tris
Amonio
Glicerol

Materiales y Mtodos
Preparacin de protenas: en NaCl
0,15 M
- Albmina de suero bovino (BSA)
- Quimotripsingeno A
- Citocromo c
- Hemoglobina
- Albmina de suero humano
Bausch & Lomb Spectronic

Preparacin de reactivo:
- 100 mg Azul de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol 95%
- Aadir 100 mL de cido fosfrico 85%
- Diluir a 1 L con agua

Materiales y mtodos
Procedimiento

10 100 g Muestra
proteica
(Microensayo: 1-10 g) o
blanco
V = 0,1 mL
Tubos de
ensayo 12 x
100 mm

Medir
absorbancia
595 nm
Graficar Abs
vs g de
protena

5 mL (1 mL) o
de reactivo.
Mezclar

Incubar entre 2
min y 1 h

Resultados

Ensayos por triplicado

No lineal superposicin del espectro de las formas roja y azul del colorante
Dispersin: variacin en coeficiente de extincin, mtodos, eficiencia del colorante
Cuatro veces ms sensible que Lowry

Resultados
Estabilidad
de 4% por
1h

Ideal:
medir
absorbancia entre los
5 20 min posteriores
a la incorporacin del
reactivo

Resultados

Tal et al. (1985)

Tal et al. (1985)

Diferencias en las curvas de varias protenas

Propiedades
inherentes de la
protena?

Coomassie R
interacta
similar a
Coomassie G?

Anlisis de Scatchard
Protenas estudiadas:
-

Citocromo c
Lisozima
RNasa A
Tripsina
Pepsina
Pepsingeno

Correlacin entre
interaccin con Coomassie
R y Coomassie G

Materiales y mtodos
Electroforesis en geles de poliacrilamida

Electroforesi
s en disco

Incubacin con
agitacin a 37 C /
18 h

Medicin de
absorcin a 595
nm

Tincin de gel: Solucin

azul de Coomassie R al
0,05% en cido
tricloroactico al 14%

Incubacin en
dimetil sulfoxido

Corte de
banda de
protena

Incubacin con
agitacin a 37 C /
18 h

Decoloracin:
actico 7% +
metanol 5%.

Resultados

F i g . l a . Response of proteins to
Coomassie G.

F i g . l b . DMSO extraction of Coomassie R

bound by various proteins.

Resultados
Metodologa: Electroforesis
de cantidades constantes de
protenas con concentraciones
decrecientes de Coomassie R

Molculas de
colorante unidas
por protena:
-

Fig. 2. Scatchard analysis of the

binding of Coomassie R to proteins

Lisozima: 48
Citocromo: 45
Pepsina: 11
Gramicidina S: 4,4

Resultados

Azul de Coomassie R-250

Correlacin entre intensidad

de color y basicidad de
protena

Asociacin
electrosttica
involucra grupos sulfnicos y
aa bsicos.

Distribucin
de
cargas,
hidrofobicidad de residuos
afecta
el
nmero
de
molculas unidas

Resultados

Fig. 3a Response of homopolymers to

Coomassie G.

Fig. 3b. DMSO extraction of

Coomassie R bound by two
homopolymers

Unin de molculas de Coomassie a aminocidos bsicos

Zor y Selinger (1995)

Formas del azul de Coomassie

Formas de Coomassie en equilibrio en el ensayo a pH cido

Forma roja.
Forma azul.
Mxima absorbancia: 470 nm Mxima absorbancia: 590 nm

Forma verde.
Mxima absorbancia: 650 nm

Formacin del complejo colorante-protena depende de la concentracin

de ambos componentes

Chial et al. (1993)

Materiales y mtodos
Reactivo:
- Preparado segn Bradford (1976)
Determinacin de protena:
Para 1 mL: 0,8 mL de
reactivo + 0,2 mL de
muestra proteica o blanco
(x2)
Para 0,25 mL: de
volumen

Varian Cary 1E UV/VIS

Mezclar.
Incubar 5-60
min

Medir absorbancia

Microplate
autoreader EL309
BIOTEK

Resultados
-

Espectro
obtenido
por
adicin
de
reactivo a exceso de
protena
Complejo colorante
protena no absorbe
a 466 nm

Resultados
Formacin del complejo colorante-protena no es proporcional a la
concentracin de la protena y depende de la concentracin de
colorante y el coeficiente de equilibrio de la reaccin
Donde:
P = protena
D = colorante

Constante de
equilibrio

fb = fraccin del la
forma
azul
del
colorante
n = N de sitios de
unin
de
la
protena
D = promedio
coeficiente
absorcin molar de
tres
formas
colorante

de
de
las
del

Resultados
Grfico estndar de Bradford
R2 = 0,976
SD = 1,2%

Correccin mediante
relacin A590/A450
R2 = 0,999
SD = 0,9%

Sensibilidad aumenta en un orden de

magnitud

Resultados

Deteccin de cantidades tan

pequeas como 50 ng

Procedimiento aplicable a
cualquier protena estndar

Resultados
Grfico estndar de Bradford

Correccin mediante
relacin A590/A450
-

Concentracin final de SDS

mayor
a
0,002%
crea
interferencia.
Es posible determinar hasta 0,3
mg/mL de protena solubilizada
por SDS 1%

Georgiou et al. (2008)

Materiales y mtodos
Estudio espectral de unin de CBB a protenas:
9 mg de CBB
por mL de
bffer fosfato
5 mM

Centrifugaci
n 12000 g / 5
min

Dilucin de
sobrenada
nte

Ensayos de Bradford y Sedmak y Grossberg:

Mtodos originales

Ensayos hidrofbicos con CBB-TCA/AS:

Preparacin
de reactivo
CBB-TCA

Centrifugacin
5000 g / 5 min

Medicin de
absorbancia a 610
nm
TCA: cido tricloroactico
AS: sulfato de amonio

Incubacin
5 min

0,05 mL de protena +
0,95 mL de reactivo
CBB-TCA

Materiales y mtodos
Microensayo (bajas concentraciones de protena)
Preparaci
n de
reactivo
CBB-AS

Centrifugaci
n 5000 g /
5 min

Medicin de absorbancia a
610 nm

0,5 mL de protena
+ 0,5 mL de
reactivo CBB-AS

Incubaci
n 5-10
min

Resultados

Especie aninica absorbe 3 veces ms que la catinica y 1,9 veces ms que la

neutral
Especies aninicas y neutras se unen a las protenas
pH dependiente
Especies catinicas no unen protena

Resultados

AS y TCA promueven una mayor unin de las especies neutras a la protena

TCA precipita protenas por deshidratacin y desnaturalizacin, incrementando
interacciones hidrofbicas y de van der Waals.
AS incrementa interacciones por ordenamiento de molcula de agua

Resultados

Especie aninica

AS

TCA

La forma aninica une protenas con un mximo de absorbancia igual al de la

forma neutra
Unin de protena a especie aninica es por interaccin electrosttica.

Resultados

Especies
neutras
aumentan
al
incrementar
concentracin de AS
y pH

Especies
neutras
disminuyen
al
incrementar
concentracin
de
TCA

Redmile-Gordon et al. (2013)

Redmile-Gordon et al. (2013)

Extractos de suelo
Materia orgnica humificada

Polifenoles

Sobreestimacin de Bradford

Lowry

Mejores estimados

Mtodo modificado (Frolund et al. 1995)

Materiales y mtodos

Materiales y mtodos
Extraccin de suelo:
Protocolo de Wright y Upadhyaya (1996)
Citrato de
sodio +
suelo en
tubos de
centrfuga

Autoclavar a
121 C / 30
min

Enfriar y
centrifugar
3500 g / 4 C /
20 min

Preparacin de
estndars en PBS
y con cidos
hmicos

Ensayos
Bradford y
Lowry

Decantar y
almacenar
sobrenadante a 4
C
Preparacin
de suelos en
PBS

Bradford:
Bradford assay kit

25 uL de
PBS +
muestra

Incubaci
n 7 min

Medicin a 595 nm

Materiales y mtodos
Lowry
Lowry modificado:
sin sulfato de
cobre

Folin-Fenol.
Incubacin 30
min

Preparacin de
reactivos A y B
3,5 veces ms
concentrado

Incubacin en
oscuridad 10
min

50 L de
muestras en
microplacas +
PBS

Aadir
Reactivos A y
B

Medicin de
absorbancia a
750 nm

Efecto de citrato - Lowry

Extracto de suelo
+ PBS + BSA

Agregar citrato.
Llevar a Vf =
100 uL con PBS

Lowry modificado

Resultados
Adicin de citrato no
causa
diferencias
significativas en la
estimacin por Lowry

Resultados

Bradford
Sobreestimacin por efecto de HA

Lowry modificado

Resultados
Extractos de suelo

Bradford
Sobreestimacin por efecto de HA

Lowry modificado

Resultados

Bradford
Supresin del color subestimacin de
protena por presencia de polifenoles

Lowry modificado

Resultados

Alto contenido de polifenoles

Suelos 1 y 2: menor radio que suelo 3

Desarrollo del color por polifenoles causa falsos positivos
Lowry: adecuado para estimar protenas totales

GRACIAS