Elisa: Inmunoensayo

ELISA
Los anticuerpos inducidos por vacunas o presentes en la poblacin en estudios
inmunoepidemiolgicos, pueden ser medidos por tcnicas in vivo e in vitro.
Entre los ensayos in vitro no funcionales para la deteccin de anticuerpos, el ELISA
(Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay)
Se apoya de tres
caractersticas
biolgicas
fundamentales

Especificidad
antgeno
anticuerpo

Poder cataltico

Especificidad de
las enzimas

Desarrollada
por
el
investigador suizo Peter
Perlmann
y
la
investigadora
Eva
Engvall,
de
la
universidad
de
Estocolmo en 1971

ELISA:

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

(ELISA)

El ELISA se basa en detectar antgenos o

anticuerpos inmovilizados sobre una fase
solida, la deteccin se genera de manera
directa o indirectamente a travs del uso
de anticuerpos o antgenos marcados
con una enzima la cual produce una
coloracin que puede ser medida de
acuerdo a su intensidad, mediante el uso
de
un
espectrofotmetro
o
un
colormetro.

Ventajas:
Los ensayos que usan como marcador enzimas presentan
ventajas tales como:

Elevada sensibilidad, detectabilidad y especificidad.

Equipamiento relativamente barato.

Procedimientos tcnicos rpidos y sencillos.

Alta precisin y exactitud.

Reactivos relativamente baratos y de larga vida.

Gran variedad de substratos y cromgenos que incrementa su

versatilidad.

Se basa en:
1) El antgeno y anticuerpo pueden
enlazarse
a
una
superficie
portadora insoluble y retener su
reactividad inmunolgica.
2) Las enzimas tienen actividad
especfica alta y convierten una
cantidad relativamente grande de
sustrato en producto detectable, lo
que
permite
detectar
concentraciones muy bajas del
ligando.

3)
la
actividad
enzimtica
o
reactividad
inmunolgica de los conjugados se preserva y
permanece estable durante el anlisis y el
almacenamiento.
4) las enzimas no estn presentes en el lquido
biolgico que se va a analizar.

En este ensayo se usan:

Anticuerpos:
Origen
monoclonal
anticuerpos pueden:

policlonal.

Estos

Suministrarse como antisuero no fraccionado

o fracciones de inmunoglobulina purificada.
Pueden ser solubles o estar inmviles en un
soporte slido.
Emplearse como conjugados no marcados o
enzimticos.
Pueden reaccionar con un determinante
antignico especfico de un antgeno o de un
anticuerpo ligando-especfico (anticuerpo
primario).

En este ensayo se usan:

Antgenos:
Purificados o producidos con tecnologa
recombinante.
Conjugados marcados o enzimticos y son
inmviles o solubles.

Enzimas
Se utilizan como Marcador por:
Su poder cataltico
Su alta especificidad
El amplio espectro de substratos que pueden usarse
Gran estabilidad de los conjugados

Las enzimas ms usadas en los ensayos heterogneos son:

Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
-galactosidasa, glucosa oxidasa
Ureasa, glucoamilasa
Acetilcolinesterasa
Glutamato descarboxilasa y anhidrasa carbnica.

Clasificacin de los ELISAs

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
ELISA competitivo

ELISA Directo
Las
placas
ELISA
se
preparan recubriendo los
pocillos con las soluciones
en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se
incuban con anticuerpos
marcados.
Indican
la
presencia de antgeno en
la solucin analizada.

ELISA indirecto
Uso dos anticuerpos: uno primario contra
el antgeno y uno secundario marcado
contra el primario.
La deteccin tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de seal
debida a la unin de dos o ms
anticuerpos secundarios por cada primario.
Es el ensayo ms popular, pues un mismo
anticuerpo secundario marcado y un
mismo
sistema
enzimtico
permiten
cuantificar
una
gran
variedad
de
antgenos.

ELISA sndwich doble anticuerpo (DAS)

1) Se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antgeno.
2) Se lava el exceso de anticuerpo
3) Se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antgeno, que ser retenido en el
pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
4) Se hace segundo lavado que elimina el material
no retenido
5) Se aplica una solucin con un segundo
anticuerpo anti-antgeno marcado.
As, pues, cada molcula de antgeno estar unida
a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca.

ELISA HADA
1. Fijacin de anticuerpos especficos al soporte.
Lavado
2. Adicin de la muestra problema. Lavado.
3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno
a detectar (deben tener un eptopo diferente de los
anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte). Lavado.
4. Adicin de anticuerpos conjugados con una
enzima anti-anticuerpos empleados en el paso
anterior. Lavado.
5. Adicin de un substrato.

ELISA Competitivo
El anticuerpo de la muestra va a competir con el
conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del
antgeno. Habr ausencia de color en una muestra
positiva debido a que el sustrato no encontrar a la
enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra.
1. Fijacin insoluble
soporte. Lavado

de

anticuerpos

especficos

al

2. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de

antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior,
marcados con una enzima y antgenos desconocidos
objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente
antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior,
marcados con una enzima. Lavar.

3. Adicin de un substrato de la enzima marcadora.

4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son
anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los
anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las
lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado
serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la
diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del
antgeno problema en la muestra.

Lectura e interpretacin de los

resultados
La lectura de los resultados puede ser valorada tanto
visual como colorimtricamente.
A simple vista, pueden ser ledos ciertos ensayos
rutinarios en los que no haga falta una cuantificacin
Automatizacin de la lectura con un simple colormetro
o espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados
equipos de lectura automtica de microplacas.
Los resultados finales de la lectura colorimtrica se
reflejan
numricamente
mediante
valores
de
absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la
longitud de onda ms adecuada para la coloracin final
alcanzada.

Aplicaciones
Enfermedades producidas por parsitos
Enfermedades producidas por Micoplasmas
Enfermedades producidas por bacterias
Enfermedades producidas por virus
Hormonas
Cuantificacin de inmunoglobulinas
Inmunocomplejos circulantes y Patologa Vegetal:
Enfermedades producidas por virus bacterias y por
hongos en plantas

Video:
https://www.youtube.com/watch?v=Jmrv137VQIA