EXTRACCIN DE ARN CON SOLUCIN

Homogenizado de
DE CHONCZYNSKI

muestra vegetal
pulveriza
previamente y
conservada en
nitrgeno lquido a
-196C

SOLUCIN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO A pH REDUCIDO ACETATO DE SODIO FENOL CLOROFORMO

CENTRIFUGAC
IN A 4C
ALCOHOL
ISOPROPLIC
O

FASE ACUOSA
ARN TOTAL
FASE ORGNICA
ADN, PROTENAS Y
LIPIDOS DISUELTOS

FASE ACUOSA
ARN
TOTAL

PELLET DE
ARN TOTAL

RETROTRANSCRIPCIO
N INVERSA
Transcriptasa inversa

- La Transcriptasa inversa cataliza tres reacciones principales:

Sintesis de DNA dependiente de RNA.
Degrdacin de RNA.
Sintesis de DNA dependiente de DNA.

- Requieren de un cebador para la iniciar la sntesis tRNA.

- Carecen de actividad exonucleasa 3

5 correctora de pruebas.

LA REACCION EN CADENA
DE LA POLIMERASA

 Lareaccin en cadena de la polimerasa, conocida comoPCRpor sus siglas en ingls

(polymerasechainreaction),esunatcnicadebiologamolecular,cuyoobjetivoesobtenerungrannmero
de copias de un fragmento deADNparticular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica
copiadeesefragmentooriginal,omolde.
SirveparaamplificarunfragmentodeADN;suutilidadesquetraslaamplificacinresultamuchomsfcil
identificarconunamuyaltaprobabilidad,virusobacteriascausantesdeunaenfermedad,identificarpersonas
(cadveres)ohacerinvestigacincientficasobreelADNamplificado

FUNDAMENTO:

Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de losADN

polimerasasparareplicarhebrasdeADN,paralocualseempleanciclos
dealtasybajastemperaturasalternadas parasepararlashebrasdeADN
recin formadas entre s tras cada fase dereplicaciny, a continuacin,
dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente.

Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas

sedesnaturalizabanalrealizarloscambiosdetemperaturayeranecesario
agregarnuevaspolimerasasencadaciclo.

Las temperaturas del ciclo (95C en las fases dedesnaturalizacindel

ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se
emplean
ADN
polimerasas
termoestables,
extradas
de
microorganismosadaptados a vivir aesastemperaturas,restrictivaspara
la mayora de los seres vivos. como:Thermus aquaticus(polimerasa
Taq),

Thermus aquaticus

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado

mediante un aparato llamadotermociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la
temperaturasimplementeinvirtiendolacorrienteelctrica.
Necesariaparacadaetapadelareaccin.

Los tubos usados para PCR tienen una pared muy

fina, lo que favorece una buenaconductividad
trmica, permitiendo que se alcance rpidamente
elequilibrio trmico. Casi todos los termocicladores
calienta la tapa de cierre con el fin de evitar
lacondensacinsobrelostubosdereaccin

OPTIMIZACIO
N
LaPCResunatcnicadegransensibilidad,necesitaunamnimacantidaddeADNparaobtenerungrannmerode
copias.Adems,puedesermuypropensaaerroressisellevaacaboencondicionesinadecuadasdeesterilidad,que
conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones
inciertas).

Se han de tomar una serie de precauciones para evitar lacontaminacinconADN extrao. Ejemplos en los que es
especialmente importante la amplificacin son la deteccin de enfermedades o el diagnstico de identidad
yparentesco.Posiblesprecaucionesson:
Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificacin: recogida, envo, custodia y procesado de
muestras.
Limpiezaexhaustivayesterilizacin(leja,etanol,luzUV)delasuperficiedetrabajoentrelarealizacindeunaPCR
ylasiguiente.
Enlaboratoriosdediagnsticogentico,sesuelentenerreasseparadasdetrabajo:unlaboratorioparalapreparacin
delamezclamadreparalaPCR,otroparalaadicindelADNaamplificar,otrodondeseencuentralamaquinaria
pararealizarlaPCRyotrodondeseabreyanalizalamuestrayaamplificada.
Cabinasdeseguridadbiolgicaparareducirvaporescargadosdeampliconesdeenfermedades.
Proteccin adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata,

CICLO DE AMPLIFICACION
El proceso de PCR por lo general consiste en
una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos de 2-3 pasos a
diferentestemperaturas.
Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos
por un choque trmico (llamado "hold") a alta
temperatura (> 90C), y seguido por otro hold
al final del proceso para la extensin de
productofinaloelbrevealmacenaje.
Dependen de gran variedad de parmetros:
como la enzima usada para la sntesis de ADN
(la polimerasa Taq, la temperatura de mxima
actividadesten75-80C),laconcentracinde
ionesdivalentesydelosdNTPenlareaccin,y
la temperatura de unin de los cebadores, as
como la longitud del ADN que se desea
amplificar

PASOS EN EL CICLO DE AMPLIFICACION

Inicio:
Estepasoconsisteenllevarlareaccinhastaunatemperaturade94-96C(98Cconunapolimerasatermoestable
extrema),quesemantienedurante1-9minutos.NecesarioparaADNpolimerasasquerequieranactivacinporcalor.
Desnaturalizacin:
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas del ADN). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura que se
mepleaparaladesnaturalizacindependedelaproporcindeG+Cquetengalacadena,comoellargodelamisma.
Otrosmtodos,raramenteempleadossonlaadicindesalesoagentesqumicosparaladesnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador:
Acontinuacinseproducirlahibridacindelcebador,esdecir,elcebadorseunirasusecuenciacomplementaria
enelADNmolde.Paraelloesnecesariobajarlatemperaturaa40-68Cdurante20-40segundos(segnelcaso),
permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgenoestables entre las cadenas deADN (uninADN-ADN)
sloseformancuandolasecuenciadelcebadoresmuysimilaralasecuenciadelADNmolde.Lapolimerasauneel
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizarADN. Los cebadores actuarn como lmites de la
regindelamolculaquevaaseramplificada.

 Extensin o elongacin de la cadena:

ActalaADNpolimerasa,tomandoelADNmoldeparasintetizarlacadenacomplementariaypartiendodelcebador
como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTPcomplementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperaturaparaestepasodependedeelADNpolimerasaqueusemos
Elongacin final:
Etapanicaquesellevaacaboaunatemperaturade70-74Cdurante5-15minutostraselltimociclodePCR.Con
ellaseaseguraquecualquierADNdecadenasimplerestanteseatotalmenteampliado.
Conservacin:
Esteesunpasoquesellevaacaboa4-15Cduranteuntiempoindefinidoparaconservarlareaccinacortoplazo.
Paraverificar que laPCRhagenerado elfragmento deADN, seempleantcnicasdeelectroforesis,que separan los
fragmentosdeADNgeneradosdeacuerdoasucarga,estoes,longitudyenmenormedidaydependiendodelamatriz
empleada,asutamao:tpicamenteseempleanengeldeagarosaparafragmentosgrandes;enacrilamidaparalosms
pequeos;ymsrpidayaplicableaPCRasociadaamarcajefluorescente,laelectroforesiscapilar.

Luego de 35 ciclos el ADN es amplificado cerca de un

billn de veces

NATURALEZA EXPONENCIAL DE LA
AMPLIFICACION
N = N0 2n
N= Nmero de molculas amplificadas
N0 = Nmero inicial de moleculas
n= Nmero de ciclos de amplificacin
N

N0

n= ciclos

COMPONENTES DEL PCR

MgCl2:
CofactordelaactividadenzimticadelaADNpolimerasa
Estabilizaelcomplejoreplicativomolde-primer-taqpol.
SuconcentracinesimportanteenlaespecificidadyenlaeficienciadelaPCR.

dNTPs:
Debenutilizarseenconcentracionesequivalentes(dATP,dCTP,dGTP,dTTP).
SerequierecolocarunexcesodedNTPsperoaunaconcentracinmenorde50mM.
Taq ADN Polimerasa :

Enzimatermoestable,aisladadeT.aquaticus
Poseeunavidamediadeaprox.45mina95C
Actividadoptimaa74Ctemperaturaalacualnoseformanhbridosindeseados(especificidad)
AltasconcentracionesdeTaq.Pol.generalaformacindeproductosnoespecficos.
BajasconcentracionesdeTaq.Pol.disminuyeelrendimientoolacantidaddeproductoamplificado.
Serecomiendasuusoentre1y5U.

Oligonucletidos Iniciadores - Primers o Cebadores:

Lasecuenciadelprimersdebeserexactaomuycercanaalasecuenciablancoaseramplificada.
Lasecuenciadelprimersnodebeserhomlogaaningunaotrasecuenciapresenteenlamuestraaser
amplificada.
Losprimersdiseadosnodebenhibridarentres,ynodebensercomplementariosinternamente.
Ningunodelosoligonucleotidosseleccionadosdebecomenzarconunatiminaenelext.3.
LosoligonucletidosnodebenpresentarbasesconsecutivasCoGenelext3.
SedebemantenerunbalanceenlacomposicindebasesC/Gquenoexcedael60%.

TEMPERATURA DE HIBRIDACION:
Probablementelatemperaturadehibridacineselfactormascriticoparaaumentarlaespecificidad
delaPCRydebeseroptimizadaempricamente.ricamente.
Siesmuyaltanohabrasociacin.
Siesmuybajaaumentalaasociacinnoespecfica.

Efecto de la Temperatura de Hibridacin

amplificacin en la especificidad y en la eficiencia de
la amplificacin del VPH-16. (Williamson and Rybicki
, 1991: J Med Virol 33: 165 - 171).

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
geles de agarosa
Losproductosamplificadossevisualizanpormediodelafluorescenciadecompuestos.
El Bromuro de Etidio es un agente intercalante que se introduce entre las bases apiladas delADN y
abreunpocoladoblehlice.
SufluorescenciaaumentacuandoseunealADN(colornaranjaaliluminarloconUV).
Debemanejarseconprecaucindebidoasucaractermutagnico.

EXITO DE LA PCR
ESPECIFICIDAD

Secuenciadeloscebadores
Temp.hibridacion

EFICIENCIA

Concentracin.Mg2+(1-4mM)
Temp.Hibridacin.

FIDELIDAD

Capacidaddecopiarsecuenciasconprecisin
DependedelaenzimaTaq

Limitaciones del Punto final del PCR

PobrePrecisin
BajaSensibilidad
CortorangoDinmico<2log
BajaResolucin
EsnoAutomatizado
Discriminasolotamao
Losresultadosnosonexpresadosennmeromero
ProcesamientoPostPCR

Tiempo Real PCR

SebasaenlacuantificacindeADNmedianteladeteccinycuantificacindeunasealfluorescente,
lacualseincrementaenproporcindirectaalacantidaddeampliconesproducidosencadaciclode
PCR(entiemporeal)(Higuchi,1993;Raeymaekers.2000).

 MediantelacuantificacinsealfluorescenteencadacicloesposiblemonitorearlaPCRdurantela
faseexponencialdondeelprimerincrementosignificativodelproductodePCRsecorrelacionaala
cantidadinicialdetemplado(Livak,1995).

Aplicaciones del Tiempo Real PCR

CuantificacinViral.
Cuantificacindeexpresindegenes.
Eficaciaenlaterapiadedrogas.
MedidadelADNdaado
ControldeCalidadyvalidacindeensayos.
Deteccindepatgenos.
Identificacin de marcadores que puedan predecir sobrevivencia de pacientes con transplante de
rganos
Recurrenciadecncereshematolgicos.
FenmenosInmunolgicos.

Ventajas del Tiempo Real PCR

Mayorespecificidad,reproductibilidadysensibilidadenlacuantificacindeltemplado.
Colectalosdatosenlafaseexponencial.
El incremento en la seal de fluorescencia es directamente proporcional al nmero de
ampliconesgenerados.
Incrementodinmicoenelrangodedeteccin(107veces).
NonecesitaprocesamientopostPCR.
Detectacambioshasta2veces.

A
R
G

S
A
I
C