Identificacin Bioqumica de

Enterobacterias
Academia de Microbiologa
Q.B.P. VICTORIA SILVA ACOSTA

Introduccin
La clasificacin de las Enterobacterias esta basada
principalmente en la determinacin
de la
presencia o ausencia de diferentes enzimas
codificadas por el material gentico del cromosoma
bacteriano.
Estas enzimas guan el metabolismo de las
bacterias a lo largo de una de las diversas vas que
pueden detectarse a travs de medios especiales
utilizados en las tcnicas de cultivo in vitro.

Introduccin
Los sustratos sobre los cuales estas enzimas
pueden actuar se incorporan al medio de cultivo,
junto con un indicador que puede detectar ya
sea la declinacin del sustrato o la presencia de
productos metablicos especficos.
Seleccionando una serie de medios que miden
diferentes caractersticas metablicas del
microorganismo en estudio es posible
determinar una huella digital bioqumica para
lograr la identificacin de la especie.

Pruebas Bioqumicas usadas para la

identificacin de las especies de
Enterobacterias

Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en
microbiologa de alimentos para la diferenciacin de
enterobacterias, en base a la fermentacin de
glucosa y lactosa, y a la produccin de cido
sulfhdrico.

Principio
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena,
aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin
de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de
iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio
mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se
detectan pormedio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color
amarillo en medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico
sulfuro de hierro de color negro.

Interpretacin

Rojo de Metilo - Voges Proskauer

(RM-VP)
El tipo y la proporcin de productos de
fermentacin que se originan por la
fermentacin de la glucosa nos sirve para la
identificar las bacterias.
cido-Mixta
En esta se forman
fundamentalmente
cido lctico, actico y
succnico, adems de
etanol, H2 y CO2.

2,3 Butanodiol

En esta se forman
cantidades menores
de cido (acetato y
succinato)
y
los
principales productos
son el butanodiol,
etanol, H2 y CO2

Principio
El rojo de metilo es un indicador de pH con un
intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4
(rojo), que se utiliza para visualizar la
produccin de cidos por la va de
fermentacin cido mixta. Agregar ROJO DE
FENOL
El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un
producto intermediario en la produccin de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia
de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo.
Este se revela en presencia de alfa-naftol
dando un color rojo-fucsia

Interpretacin
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo
estable. Esto indica que la produccin de cido es
suficiente para producir el viraje del indicador y el
m.o. ferment la glucosa por la va de cido mixta.
La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojofucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de
diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

RM positivo, VP negativo: Escherichia coli

RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

Utilizacin de Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente
de carbono es una prueba til en la
identificacin de enterobacterias

Principio
La utilizacin de citrato como nica fuente
de carbono se detecta en un medio de
cultivo con citrato (Citrato de Simmons)
como nica fuente de carbono mediante
el crecimiento y la alcalinizacin del
medio. Este aumento de pH se visualiza
con el indicador azul de bromotimol
que vira al alcalino a pH 7,6.

Interpretacin
El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o
no de un viraje del indicador al azul.

Positivo: Klebsiella spp.

Negativo: E.coli

Phenilalanina Deseminasa
La fenilalanina es un aminocido que por
desaminacin oxidativa forma un cetocido, el
cido fenilpirvico. Slo los gneros Proteus y
Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo
que permite diferenciarlas del resto de las
Enterobacterias.

Principio
La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin
del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o.
en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se
agrega cloruro frrico que forma un complejo de
color verde con el cido fenilpirvico
Desaminacion de la Phenilalanina

Procedimiento

Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo

puro de 24 horas e incubar a 35C durante 18-24
horas. Luego de transcurrido el perodo de
incubacin, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de
cloruro frrico, directamente sobre la superficie
del agar.

Interpretacin
La aparicin inmediata de un color verde intenso indica
la presencia de cido fenilpirvico y una prueba positiva.
Controles:

Negativo: E.coli

Positivo: Proteus

Agar de Hierro y
Lisina
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que
producen descarboxilacin o desaminacin de
la lisina. Se puede detectar adems la produccin
de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas de
bsqueda de Salmonella, principalmente para
descartar otras bacterias que dan colonias de
aspecto similar en los medios diferenciales
utilizados durante el aislamiento selectivo.

Principio
Durante las primeras etapas de la incubacin el
fondo virar el indicador de pH del medio al cido
(amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si
el aminocido es descarboxilado se formarn
aminas que provocan un retorno al color original del
medio o hacia un viraje al bsico (color violeta).
En la desaminacin se produce un cido
carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparicin de un color rojo intenso. La produccin de
H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la
precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.

Interpretacin
Controles

P-Alk/ F-Alk/ H2S += descarboxilacin de lisina positiva.

Ej.: Salmonella choleraesuis.
P-R/ D-Ac /H2S- = desaminacin de lisina positiva,
descarboxilacin de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
P-Alk/ F-Ac/ H2S- = descarboxilacin de lisina negativa. Ej.
E. coli
P-Alk/ F-Ac/ H2S - = descarboxilacin de lisina negativa,
produccin de H2S. Ej. Citrobacter freundii.

Medios para la Movilidad, Indol Ornitina y

Sulfuros
MIO

SIM

Movilidad

Sulfuros

Indole

Indole

Ornitina

Movilidad

Medio MIO
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae
en base a su movilidad, actividad de ornitina
decarboxilasa y produccin de indol.

Principio
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a
la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena.
Adems, la triptena aporta grandes cantidades de
triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la
realizacin de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la
ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima
ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es
el indicador de pH, que en medio alcalino es de color
prpura y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en
un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina
decarboxilasa e indol.

La movilidad se de muestra por un enturbiamiento del

medio o por crecimiento que difunde mas all de la
lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un
color prpura del medio. Debido a la fermentacin de
la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin
cida y originando que el indicador de pH prpura de
bromocresol vire a amarillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas
para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa,
la cual decarboxila la ornitina presente.
Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el
consecuente viraje del indicador hacia el color
prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los
microorganismos que contienen la enzima

Interpretacin
Movilidad:-Resultado
positivo:
presencia
de
turbidez o crecimiento mas all de la lnea de
siembra.-Resultado
negativo:
crecimiento
solamente en la lnea de siembra.

Interpretacin
Ornitina decarboxilasa:-Resultado positivo:
color prpura.-Resultado negativo: color
amarillo. A veces se puede desarrollar un
color violceo en la superficie del medio.

Prueba de INDOL
Es producto de la degradacin metablica del
aminocido Triptfano. Las bacterias que poseen la
triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptfano con produccin de indol, cido pirvico y
amonaco.

Triptofanasa
cido Indolpiruvico

Triptfano

Diseminacin
cido Indolpiruvico

Indol

cido piruvico

Amonio

Principio
La prueba de indol est basada en la formacin de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo
aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el
principio activo del reactivo de Kovacs.

Indol

Triptofanas
a

piruvat
Amoni
o
o
Triptofano

Bacteri
a

Interpretacin
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase
del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir
el reactivo indica la presencia de indol y un
resultado de la prueba positiva.

Controles
Escherichia coli: Positivo
Salmonella typhi: Negativo

Ureasa
La urea es una diamida del cido carbnico que
puede ser hidrolizada con liberacin de amonaco y
dixido de carbono

Principio
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies
de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la
siguiente reaccin qumica:

Urea + 2H2O
CO2 + H2O
+ 2NH3

El amonaco reacciona en solucin para formar

carbonato de amonio, producindose alcalinizacin y
aumento de pH del medio.

Procedimiento
Inocular el caldo con una ansada cargada con el
cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del
agar. Incubar a 35C durante 24 hs

Interpretacion y
controles
Una coloracin rosa fucsia en el medio indica
hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentos
producen coloracin parcial (generalmente el pico),
los rpidos producen coloracin en todo el tubo. Si
no hay hidrlisis el medio permanece con el color
original (amarillo) y se observa crecimiento.
Controles
Negativo: Escherichia
coli

Positivo: Proteus
sp

Movilidad

Sulfuros

Descarboxilacion de la ornitina

Movilidad-Indol-Ornitina (MIO)
6563388010
Juan Martinez Prepa
Fundamento de la ticniond e azul de tripano