Analisis Asam Nukleat

Analisis Asam Nukleat

Analisis
Kualitati
f

Elektroforesis
Sequencing
Staining
Hibridisasi
Sentrifugasi

Analisis
Kuantita
tif

PCR
Spektrofotometer
DNA-Microarray
SAGE

Analisis Kualitatif

Analisis Kualitatif

Elektroforesis
Tujuan :
Memisahkan dan
mempurifikasi makromolekul
berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik.
Makromolekul yang dijadikan
objek elektroforesis adalah
protein
dan asam nukleat yang memiliki
perbedaan ukuran, kadar ion, dan
molekul-molekul penyusunnya.
Elektroforesis dapat dibagi

Analisis Kualitatif

Elektroforesis (Agarosa Gel)

Agarose gel digunakan untuk
menganalisis molekul DNA.
Agarose merupakan suatu
bentuk polisakarida yang
diekstrak dari alga merah
ataupun
rumput
laut.
Agarose
memiliki
kemurnian
jika
dibandingkan dengan agar
walaupun
memiliki
kesamaan sumber.

Analisis Kualitatif

Elektroforesis (Agarosa Gel

cont.)
Tahapan
Bubuk elektroforesis agarose dicampurkan dengan
larutan buffer untuk elektroforesis (TAE atau TBE).
Lalu campuran dipanaskan dengan microwave
hingga tercampur sempurna.
Campuran kemudian didinginkan hingga mencapai
suhu 60oC dan dituangkan kedalam wadah agar
mengental. Setelah mengental, sikat pembatas lalu
dilepaskan, sampel DNA diinjeksikan ke dalam gel
dan peralatan elektroforesis dinyalakan.

Analisis Kualitatif

Elektroforesis ( Kapiler )
Elektroforesis kapiler adalah metode cepat analisis
dan pemisahan biopolymer, termasuk didalamnya
DNA. Metode ini menggunakan celah sempit
denga kapiler-kapiler silica didalamnya dengan
internal diameter kurang dari 100 ml.
Elektroforesis kapiler menghasilkan tingkat efisiensi
pemisahan yang tinggi dan selektivitas yang baik.
Metode ini memiliki sensitivitas yang baik dan
memiliki kelebihan yaitu injeksi yang dapat
dilakukan berkali-kali pada suatu kolom.

Analisis Kualitatif

Sequencing
Sequencing
adalah
penentuan urutan
basa
DNA
dalam
segmen molekul DNA
yang relatif pendek .
Pengurutan
(sequencing)
asam
nukleat
memungkinkan
kita
mengetahui
kode
genetik dari molekul
DNA.

Ada dua metode yang

dapat digunakan untuk
mengurutkan
molekul
DNA. Metode MaxamGilbert dan
metode
Sanger. Kedua metode
tersebut
menghasilkan
fragmen-fragmen
DNA
dengan
panjang
bervariasi, yang satu
sama
lain
berbeda
sebanyak
satu
basa

Analisis Kualitatif

Sequencing (2)
Metode Maxam Gilbert
Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA
untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan
pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua
tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara
parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa
inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan
fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam
ukurannya.
basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia
tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G,
asam format menyerang A dan G, hidrazin akan
menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan
menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C.

Analisis Kualitatif

Sequencing (3)
Metode Sanger
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan
dua sifat salah satu subunit enzim DNA
polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua
sifat tersebut adalah kemampuannya untuk
menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP
dengan ddNTP.

Analisis Kualitatif

Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan proses penting dalam
isolasi dan pemisahan sel.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama
mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang
bervariasi

Analisis Kualitatif

Sentrifugasi
Sentrifugasi pada pemisahan dan isolasi sel dapat
menggunakan berbagai metode, yaitu metode
sentrifugasi perbedaan kecepatan, sentrifugasi bobot
jenis bertingkat, sentrifugasi zonal, dan sentrifugasi
isopiknik.
Metode sentrifugasi perbedaan kecepatan memiliki
prinsip pemisahan sel berdasarkan perbedaan ukuran
organel sel dan densitas partikel. Patikel organel yang
lebih rapat akan membentuk pelet jika pada kecepatan
yang lebih tinggi dibandingkan partikel organel yang
lebih besar atau renggang walaupun memiliki massa
yang sama besar. Makin besar ukuran sebuah partikel,
maka makin besar gaya sentrifugal yang dialaminya.
Oleh karena itu partikel yang memiliki ukuran yang lebih

Analisis Kualitatif

Staining
Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA
setelah diseparasi oleh gel elektroforesis.
Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat
digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya
adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green,
SYBR Safe, dan Eva Green

Analisis Kualitatif

Staining (2)
Etidium Bromida
Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum
digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat
digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga
elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini
menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah
cahaya UV. Namun etidium bromida bersifat karsinogen,
karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik.
SYBR GOLD
Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal,
rantai ganda, atau RNA. SYBR Gold merupakan salah satu
alternatif pewarna etidium bromida yang lebih sensitif
daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens
pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi
daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam

Analisis Kualitatif

Staining (3)
SYBR Green
Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan
berpotensial sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus
ditangani dengan hati-hati. SYBR Green I lebih cocok untuk
digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II
lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA.
SYBR safe
SYBR Safe merupakan pewarna yang lebih aman daripada
pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. tidak
bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam
sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat
digunakan dengan blue-light transillluminator yang
mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang
diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya.

Analisis Kualitatif

Staining (4)
Eva Green

Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang

digunakan pada PCR (Polymerase Chain Reaction).
Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel
yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve
Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan
memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan
dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki
tingkat toksisitas yang rendah.

Analisis Kualitatif

Hibridisasi
Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu
proses denaturasi atau pemisahan dua rantai
asam nukleat yang komplementer dari proses
renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai
asam nukleat. Proses denaturasi biasanya
dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk
memecah ikatan hidrogen yang terdapat di
antara pasangan basa sehingga rantai asam
nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian
diikuti dengan proses renaturasi dengan cara
pendinginan.

Analisis Kualitatif

Hibridisasi (2)
Tahapan
Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA
dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane
nitroselulosa. Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi
dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan.
Gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau
membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi
pemberat.
Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi
yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara
kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal.

Analisis Kuantitatif

Analisis Kuantitatif

Spektrometri
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis
untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan
kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi
berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer.

Analisis Kuantitatif

Spektrometri (2)
Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum
Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io)
melalui suatu media (larutan), maka sebagian
cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan
(Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Dalam menganalisis asam nukleat, spektroskopi
yang umumnya digunakan adalah spektroskopi
raman.
Spektroskopi
raman
dimanfaatkan
untuk
menganalisis DNA probe yang hendak digunakan
dalam proses hibridisasi.

Analisis Kuantitatif

Spektrometri (3)
Kemurnian =
260/280
Rentang kemurnian DNA 1.8 2.0
Kemurnian DNA <1.8 maka isolasi DNA belum murni
Kemurnian DNA >2.0 maka nilai ddH2O yang diambil
lebih banyak dari DNA

Analisis Kuantitatif

Spektrometri (4)

[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran

260 = Nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding
dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)
[RNA] = 260 x 40 x faktor
pengenceran

40 = 40ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

Analisis Kuantitatif

Microarray
Micoarray merupakan chip yang
berukuran kecil yang terbuat dari
lempengan kaca yang berisi
ribuan bahkan puluhan ribu
macam
gen
dalam
bentuk
fragmen DNA yang berasal dari
penggandaan cDNA.
Eksperimen cDNA microarray
memperlihatkan ekspresi gen
pada beberapa ribuan gen yang
mengukur secara simultan.

Analisis Kuantitatif

Microarray
Prinsip kerja dari microarray
adalah
mengukur
jumlah
hibridisasi mRNA pada cDNA
dalam chip.
Pada umumnya analisis dengan
menggunakan
microarray
menggunakan dua sampel yang
berbeda.
Kedua sampel tersebut diisolasi
mRNA-nya
dan
kemudian
diletakkan dalam chip microarray.
Chip tersebut diberi penanda
radioaktif untuk menghasilkan
warna
fluorosens
setelah
dilakukan
scanner
yang
terhubung dengan komputer.

Analisis Kuantitatif

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR atau polymerase chain reaction
merupakan suatu amplifikasi DNA enzimatik yang
sangat sensitif dan spesifik terhadap suatu
organisme tertentu berdasarkan target gen primer
yang dimiliki dan juga merupakan salah satu
metode analisis yang bersifat kuantitatif dengan
tujuan untuk memperbanyak rantai DNA secara
eksponensial. Dengan kata lain, analisis PCR juga
berfungsi sebagai kloning DNA.
Rumus untuk
dihasilkan : 2n

menghitung

jumlah

DNA

yang

Analisis Kuantitatif

PCR (Polymerase Chain Reaction) 2

Bahan bahan yang digunakan

Two primers

Forward & Reverse

Taq polymerase (DNA polymerase)

suhu yang diperlukan untuk memisahkan untai ganda DNA.

Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)

merupakan sumber nukleotida yang digunakan oleh Taq Polymerase

untuk mensintesis untai baru DNA.

MgCl2

MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor untuk enzim polymerase

Extracted DNA sample

mengandung bagian DNA yang ingin direplikasi

Thermocycler

berfungsi sebagai pengatur suhu pasa satu siklus

Microtubes dan micropipette

Analisis Kuantitatif

PCR (Polymerase Chain Reaction) 3

Pra-denaturasi
DNA Polimerase dipanaskan selama 1-9 menit
Denaturasi
pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik, DNA utas
ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
suhu diturukan 40-60oC selama 20-40 detik agar primer dapat
menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan
sekuen primer.
Ekstensi (elongasi),
menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA
polymerase, biasanya 70-72oC. DNA polymerase akan
memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya
Final Elongasi
suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk
memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna

Analisis Kuantitatif

SAGE
Serial Analysis of Gene Expression merupakan salah satu
metode
analisis
yang
bersifat
kuantitatif
untuk
mengekspresikan kode genetik dari mRNA secara digital.
Dalam metode ini, ditujukan untuk mengamati bagaimana gen
dari sebuah sel atau jaringan diekspresikan dalam bentuk
kode-kode genetik. Kode-kode genetik yang tercatat kemudian
akan disimpan dalam bentuk database secara digital untuk
dapat dianalisis.

Analisis Kuantitatif

SAGE (2)
Prinsip dasar dari metode SAGE ini adalah sequencing
dimana beberapa mRNA dari sampel uji akan diubah
menjadi sebuah rantai DNA.
Ekspresi dari gen akan diuji satu dengan yang lainnya
(misalkan ekspresi DNA dari sel yang normal dengan sel
tumor).
Metode SAGE diawali dengan cara mengekstrak mRNA dari
sampel. Kemudian, mRNA yang sudah terekstraksi akan
dipotong-potong menjadi potongan kecil secara acak
menggunakan enzim restriksi.
Potongan-potongan pendek tersebut dirangkai menjadi
satu rantai panjang yang mengandung basa nukleat yang
sudah diberi tanda.
Rantai panjang yang dihasilkan kemudian diubah menjadi
bentuk vektor agar dapat dibaca oleh komputer.
Melakukan sequencing dan memproses datanya dengan

Daftar Pustaka

Campbell NA, Reece JB. 2008. Biology. 8th ed. Upper Saddle River
(NJ): BenjaminCummings. 1393 p.

Strachan T, Read AP. 1999. Human Molecular Genetics. 2nd edition.

New York: Wiley-Liss.

Anonim. NA Detection and Indentification. [online] available at: <

http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/
GELifeSciences-us/applications/AlternativeProductStructure_11756/
> [accessed 5 November 2016]
Anonim. Nucleic Acid Analysis. [online] available at: <
http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/nucleic-acid-a
nalysis
> [accessed at 5 November 2016]