UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

DEPTO. DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PS-GRADUAO EM FARMACOLOGIA
TPICOS EM TOXICOLOGIA

MSc. Daisy Jereissati Barbosa Lima

Introduo

Envenenamento por picada de serpente

WHO- doena tropical negligenciada
Problema de sade pblica
rea rural
frica, sia e Amrica Latina
Vboras do gnero Bothrops

Venenos

Bothrops: mistura complexa de protenas e peptdeos

Variedade de atividades biolgica e farmacolgica
90%- interferncia em processor fisiolgicos

L-aminocido oxidase:

Superfamlia de protenas
Presente em todos os venenos de serpentes
Flavoenzima: catalisa a deaminao oxidativa
de L-aminocidos para sintetizar:
cetocid
o

Perxid
o de
hidrog
nio

Amnia

LAAOs
30% do total de protenas dos venenos de
serpentes
Toxicidade!
Efeitos polifuncionais em diferente sistemas
Agrega
Forma
o
Hemorra
Antimicrobi
biolgicos
o De

Plaquet
ria

Edema

Antiviral

gia

Ao
ANTI-HIV

ano

Citotoxici
dade Em
Clulas
Tumorais

Maior parte dos efeitos biolgicos: perxido de hidrognio

Mecanismo- ainda no elucidado

Bothrops leucurus

Cobra venenosa
Habitat natural- nordeste do brasil
Efeitos do envenenamento- coagulante,
hemorrgico e atividade fibrinoltica,
insuficincia renal in vivo
Induz nefrotoxicidade em rins isolados
de ratos
Citotoxicidade contra clulas epiteliais
tubulares renais

Objetivos

Avaliar o papel de um componente

principal de veneno de B. leucurus,
LAAO, para compreender melhor os
efeitos
biolgicos
produzidos
por
envenenamento
Esclarecer a nefrotoxicidade de LAAO
Investigao no s o seu potencial
nefrotxico,
mas
tambm
a
sua
citotoxicidade contra linhas de clulas
epiteliais renais

Mtodos- Cultura de clulas

rim
humano
(HK-2)

rim
canino
(MDCK)

DMEM 89%
Soro Fetal bovino 10%
L-glutamina
Antibiticos 1%

Estufa: 37C
5% CO2

Ensaio do MTT
Princpio: Anlise colorimtrica que quantifica indiretamente as clulas viveis baseada na
converso do sal de MTT, um composto de cor amarela, a formazan, de colorao prpura.

Cultura de clulas

Absorbncia
em 570 nm

Diluio em meio
de cultura

Contagem

MTT

Incubar
com
amostras

4h

12 h

Liberao de Lactato desidrogenase

(LDH)
Princpio: a LDH Catalisa a interconverso de piruvato e lactato com uma
concomitante interconverso de NADH e NAD+. A citotoxicidade induzida por LAAOBL foi avaliada pela liberao de lactato desidrogenase (LDH) no meio de cultura

Cultura de
clulas

Contage
m

Promega kit
(6179A)
.
Absorbncia 30 min
em 570 nm

Diluio em
meio de cultura

LAAO-BL

12 h

Resultados LAAO-Bl induces necrosis

and apoptosis in renal epithelial cell

lines

Externalizao da
fosfatidilserina-anexina V + PI
11

Princpio: A incubao com Anexina V permite a ligao desta molcula

fosfatidilserina de clulas apoptticas e posteriormente

ficoeritrina

ligada Anexina V causa fluorescncia detectvel por citometria de fluxo.

7- AAD
(vermelhoHlog)

Necros
e

Apoptose
tardia

Legen
da
Fosfatidilseri
na

7 AAD
Viveis

Apoptose inicial

Anexina V (amareloHlog)

Anexina
V

Resultados LAAO-Bl induces necrosis

and apoptosis in renal epithelial cell

lines

Potencial De Membrana Mitocondrial

(m) Por Microscopia De
Fluorescncia

LAAO-BL

TMRE- 15
min
30 C

Luz- 5
min

Potencial de membrana mitocondrial

(m) por Citometria de fluxo

Clulas MDCK - LAAO-Bl (50 ug / mL, 12 h)

TMRE (25 nM, 15 min, 37 C)

Ao abrigo da luz

Resultados LAAO-Bl exposure induces

mitochondrial hyperpolarization, intracellular
Ca2+ mobilization and ROS generation in
MDCK cells

C+ FCCP- Desacoplador

C+ TBHP- perxido
orgnico processos

Mensurao do clcio

MDCK

Acetoximetil ster de fura-2 (fura-2AM) + Tampo

LAAO-Bl (50 ug / mL)

Medies citoplasmticos de Ca2 + foram avaliadas

por microscopia de fluorescncia
Fura-2AM + Tampo

LAAO-BL

Resultados LAAO-Bl exposure induces

mitochondrial hyperpolarization, intracellular
Ca2+ mobilization and ROS generation in
MDCK cells

TG- Tapsigargina
Inhibidor
no
competitivo da Ca

2APB- inibidor de clcio via

IP3R
Ryd- Rianodina: inibidor de

CAT- catalase
Bapta- quelante de
clcio

Mensurao de espcies reativas de

oxignio (ROS) citoslica
Princpio: Na presena de EROs intracelular o composto H 2-DCF-DA
convertido em um produto altamente fluorescente (DCF).
Centrifugao e
diluio em PBS

LAAO-BL 50 ug /
mL, 12 h

H2-DCFH-DA
C+ t-BHP, 5
Clulas M
DCF
H2-DCFHDA

0,5 h

Mensurao da atividade Caspase 3/7

LAAO 50 ug/mL
Lise das clulas- tampo de extrao
Resfriamento
Centrifugao
Sobrenadante coletado e quantificado- BCA
Protena total + Tampo de caspase+ Ac DEVD-afc
do substrato da caspase 3
Atividade DVDase- monitorada continuamente
quanto a liberao de afc fluorescente a 37

Immunoblotting
20

Princpio: Verificar a expresso aumentada ou diminuda de protenaschave associadas morte celular (apoptose).

1. Extrao das
protenas
2. Quantificao
3. Eletroforese
4. Imunodeteco

Anticorpos:
Caspases 3
e7
Alpha
tubulina

Resultados LAAO-Bl activates Bax,

caspases 3 and 7 in epithelial kidney

cells
Z-VAD- Inibidor
de caspase

PROTENAS
TOTAIS

EXTRATOS
CELULARES

Perfuso renal
Ratos Wistar
machos
adultos (260320 g)

Jejum por 24
horas com
livre acesso a
gua.

Anestesiados
com
pentobarbiton
a de sdio (50
mg / kg, i.p.)

perfusato
consistiu de
uma soluo
de KrebsHenseleit
modificado
(MKHS)

artria renal
direita foi
canulada
atravs da
artria
mesentrica
sem
interromper o
fluxo de
sangue

Dissecao do
rim direito

Perfuso renal
100 mL de MKHS
foram
recirculados
durante 120 min

Presso
de
perfuso
(PP)

Resistnc
ia
vascular
renal
(RVR)

A presso de
perfuso (PP) foi
medida na ponta
da cnula de ao
inoxidvel na
artria renal.

Amostras de
urina e
perfundido foram
recolhidas em 10
min para anlise
dos nveis de
sdio, potssio e
cloreto

Osmolalidade foi
medida em
osmometro de
presso de
vapor,

Inulina foi
adicionada ao
sistema 30
minutos aps o
incio de cada
perfuso

Fluxo
urinrio
(UF)

Taxa de
filtrao
glomerular
(TFG)

sdio (% TNA
+), potssio (%
TK +) e cloreto
(% TCL)

taxa de
transport
e tubular

LAAO-Bl induced alterations in rat isolated

kidney

Discusso

Insuficincia renal aguda - complicao

comum de envenenamento por Bothrops

Patognese da insuficincia renal:

Alta
concentrao
de veneno no
tecido renal

Ao direta de
componentes do
veneno em
tbulos renais e
clulas epiteliais
renais

Hemoglobinria

Ocluso vascular
e estresse
oxidativo

Discusso

LAAO-Bl induziu morte tanto em HK-2 quanto em MDCK

por mecanismos diferentes- Anexina V

Apoptose e necrose na resposta a LAAO em diferentes

tipos celulares

Clulas epiteliais tubulares- alvo de venenos para injria

aguda do rim
Disfuno
Desequilb
Estresse
Privao
Apoptose- perda da
funo renal
mitocondr
rio do
oxidativo
de energia
ial
clcio
Importante no dano renal por
venenos
LAAO- Hiperpolarizao mitocondrial em
clulas MDCK
Gerao de ROS

C m aumenta aps induo de apoptose iniciada por ROS, Clcio,

Discusso

Induo de apoptose por LAAO- gerao de H 2O2

Aumento e diminuio de ROS e H2O2 foi monitorado com
DCFH-DA aps estimulao com LAAO em MCDK
Remoo de H2O2 pela catalase diminuiu, aproximadamente,
50% dos efeitos apoptticos: H2O2 tem um papel principal na
induo de apoptose mediada por LAAO-Bl.
Aumento do Ca2 + citoslico mediado por LAAO-Bl (50 ug /
mL) era de retculo endoplasmtico (ER), atravs de
receptores de IP3
ROS e estresse oxidativo perturbam a funo do ER, induzindo
um aumento de Ca2 +
Apesar de Ca2 + participar de danos celulares, BAPTA-AM no
foi capaz de reduzir a apoptose regulada por LAAO-Bl

Discusso

Dois principais vias de sinalizao de apoptose,

incluindo as vias intrnsecas e extrnsecascaspases para iniciar a morte das clulas
LAAO-bl desencadeou a activao de caspase 3 e
7 em MDCK e clulas HK-2.
Tratamento com LAAO- expresso de protenas
pr-apoptticas Bax
Outros relatos mostraram que a apoptose
induzida atravs de LAAO depende de caspase

Discusso

LAAO-Bl no rim sem interferncia de fatores sistmicosperfuso no rim de rato LAAO- Bl (10 ug / ml) aumento na presso de perfuso e de fluxo de urina,
sem efeito na resistncia vascular renal.
Diminuio na taxa de filtrao glomerular
Reduo- transporte tubular de sdio, cloreto e potssio
Perda da funo tubular clulas epiteliais induzida por
LAAO- Bl: efeitos renais observados neste estudo
(aumento do fluxo de urina e reduo do transporte de
eletrlitos)
Veneno de B. Leucurus tambm reduziu a taxa de
filtrao glomerular, mas diminuiu o PP e UF

Discusso

Enzimas em veneno de Bothrops: Laminocidos oxidase , fosfolipase A2,

metaloprotease
e
esfingomielinasetoxicidade renal
Perfuso dos rins isolados de ratos com
LAAO com lectinas do tipo C, fosfolipase
A2 (PLA2), miotoxinas e enzima trombinalike a partir de venenos de Bothrops
causou perturbaes da funo renal

Concluso

LAAO-Bl induz alteraes intensas na fisiologia renal,

avaliado no rim isolado de rato;

Nefrotoxicidade-

perda

da

funo

das

clulas

epiteliais tubulares (apoptose estresse oxidativo);

Resultados - compreenso dos mecanismos de

nefrotoxicidade das enzimas;

Eventos moleculares: leso renal aguda causada por

ofidismo, contribui para desenvolver medicamentos
e estratgias teraputicas mais eficazes.

Obrigad
a!