Técnicas em Imunologia

Parte I
Métodos Laboratoriais em Imunologia

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

 Técnicas baseadas em
imunoglobulinas
Ensaios Liquídos Ensaios Sólidos

(ensaios homogéneos)
(ensaios heterogéneos)
 Difração da luz
 Nefelometria

 turbidimetria
 ELISA
 Competitivo
 Outros ensaios liquidos
 EMIT  Não-competitivo
 CEDIA
indirecto
 Imunofluorescência
 Aglutinação
 RIA
 Quimioluminescência

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas baseadas na difracção da luz
Nefelometria
 Baseada na reacção de
imunoprecipitação
 Mede a quantidade de luz
difractada devido à presença de
complexos imunológicos
 O ângulo de difracção e o
comprimento de onda são
aspectos importantes
 31º permite melhor razão
sinal/ruído
Prof. Doutor José Cabeda
Imunoturbidimetria
 Baseada na reacção de
imunoprecipitação
 Mede a diminuição de luz que
consegue atravessar uma
solução na presença de
complexos imunológicos
 O detector está sempre alinhado
com a fonte de luz (0º), pelo
que a medida não é da luz
difractada, mas da não
difractada
Técnicas de Imunologia
Curva de imunoprecipitação
 Assumindo:
 Ig pelo menos bivalentes IgG

 Antigénio com pelo menos 2

epitopes
 Se Ab em excesso, um aumento
de Ag implica um aumento da
reacção
 Se Antigénio em excesso, um
aumento de antigénio diminui a
probabilidade de um Ab ligar 2
antigénios, o que diminui a
precipitação
 A quantificação só é possível se o
anticorpo estiver em excesso

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Cinética da Curva de imunoprecipitação
 A reacção inicia-se
imediatamente, sendo visivel
20s após a adição do antigénio
 A reacção prossegue de modo
aproximadamente linear até que
a precipitação dos complexos
origina uma aparente
diminuição da reacção

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Rate Nephelometry
 [Ab] é constante
 Aumento progressivo da
[antigénio]
 Deve ser realizada na zona de
excesso de Ab
 Em nefelómetros automáticos
deste tipo, 2 [antig] são
inicialmente ensaiadas.
Dependendo do resultado:
 São testadas novas []

 É testada o excesso de antig

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

End-point nephelometers
 Medida no ponto
máximo da reacção
 Medida de branco ou
no inicio da reacção
 Valor interpolado de
uma curva de
calibração
 Variações
 Particle enhanced

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Particle enhanced nephelometry
 São utilizadas particulas de latex
conjugadas com anticorpo ou antigénio
competidor
 Aumento de sensibilidade

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

 Ensaios
 Requisitos
 Qualquer fluido

 Soro

 Plasma

 Urina

 CSF

 Deve ser diluído (para não

interferir na leitura)
 Amostras ricas em lipídios devem

ser clarificadas por filtração ou

ultracentrifugação
 Amostras ictéricas ou hemolisadas

 Não afectam a nefelometria

 Afectam a turbidimetria

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Outro ensaios homogéneos
CEDIA EMIT
(Cloned enzyme donor assay) (Enzyme multiplied immunoassay
 B-galactosidade em 2 fragmentos technique)
inactivos  Aumento ou diminuição da
 enzyme donnor actividade enzimatica com a
 Enzyme acceptor
reacção Ag-Ab
 A reacção imune junta-os
activando a enzima.
 Se não houver antigénio o
anticorpo liga-se à enzima
inactivando-a

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Imunofluorescência
 Anticorpos conjugados com
compostos fluorescentes
 Conjugado utilizado como
revelador directo
 Aumento de 10 a 1000 vezes na
sensibilidade
 Grande aumento na rapidez de
detecção
 Vantagens relativamente à RIA:
 Tão sensivel

 Reagentes mais estáveis

 Mais fácil de implementar

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Principais fluorocromos utilizados

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de imunofluorescência (I)
 Directas
 Anticorpo directamente conjugado

 Indirectas
 Anticorpo secundário conjugado

 Acopladas
 Duas reacções acopladas

 Fluorescence polarization immunoassay

 Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida

quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o

que se deve às restrições ao movimento rotacional do
antigénio no complexo

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de imunofluorescência (II)
 Fluorescent Quenching assay
 Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa

 Competição para o ab entre o antigénio marcado e o

não marcado (a testar)

 A fluorescência é absorvida (quenched) quando o

antigénio marcado se liga ao anticorpo

 A intensidade de fluorescência é uma medida da

quantidade de antigénio não marcado que competiu

para o anticorpo
 Método indirecto

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de imunofluorescência (III)
 Substrate labelled Fluorescent immunoassay
 Método indirecto

 Analito ligado a um modulador que

influencia o sinal gerado

 Actividade do modulador

influenciada pela ligação do Ab

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de imunofluorescência (IV)
 Fluorescent energy transfer immunoassay
 Método competitivo

 Analito conjugado com FITC

 Anticorpo ligado a Rodamina

 Se o analito conjugado ligar ao

anticorpo, por ressonância a energia

do FITC excita a rodamina
 Se por competição, o analito impedir

o anticorpo de se ligar ao conjugado,

não haverá excitação da rodamina

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

 Problemas da imunofluorescência
 Autofluorescencia  Quenching
 Proteinas do soro (320-
 Bilirrubina
350nm)
 Bilirubina (430-470nm)  Hemoglobina
 Urina apresenta elevada linha

de base
 Fotodestruição
 Diminuição da
 Para obviar a estes problemas
pode-se fluorescência ao
 Tratar a amostra com
longo da excitação
 Enzimas proteoliticas

 Agentes oxidantes

 Agentes desnaturantes

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Aglutinação
 Baseada na reacção ag-ab
 Observada visualmente
 Tipos:
 Directa (ABO)

 IgM aglutina várias RBC

 IgG necessita de reagente de

Coombs (anti-human-ab) para fazer

a ponte
 Indirecta ou passiva

 Antigénio ligado a subtância inerte

 Reversa

 Anticorpo ligado a substância inerte

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Aglutinação de partículas
 Mais sensiveis que a aglutinação
 Mensurável por nefelometria, turbidimetria,
contagem de particulas
 Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas
de látex
 Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de
solução
 A medida das partículas em solução é
inversamente proporcional ao titulo a determinar

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Ensaio quimioluminescente
 Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção
de oxidação-redução
 O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10-18 a
zeptomole=10-21)
 Compostos utilizados:
 Esteres de acridina (detecção do NaOH e H O )
2 2

 Limite de detecção de 0.5 atomoles

 Derivados do isoluminol (detecção com H O e um catalizador)

2 2

 Limite de detecção de 50 atomoles

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Enzimas utilizadas em ensaios
Quimioluminescentes

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Ensaios em fase sólida
 ELISA
 Competitivo

 Não competitivo-indirecto

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Ensaios em fase sólida
 ELISA
 Sandwich ou de captura

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Resolver problemas do ELISA

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Electroforese de Imunoglobulinas
 Electroforese em agarose de alta resolução
 Imunofixação
 Imunosubtracção
 Electroforese capilar

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Electroforese de Ig em agarose

Electroforese + Corar com Ponceau S e secar

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Imunofixação
 Electroforese
 Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo
monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um
precipitado onde houver Ig correspondente
 Proteinas não pp são lavadas
 Corar os pp com amido black nigrosin

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Imunosubtracção

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Crioglobulinas (I)
 Tipo I
 Monoclonal (IgG, IgM,

IgA, raramente c.leves)

 Tipo II
 Mistas (2 ou mais Ig,

sendo uma monoclonal)

 Tipo III
 Policlonal

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Crioglobulinas (II)

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia