CENTRO DE INVESTIGACIN EN ENFERMEDADES

INFECCIOSAS.

Maestra en Ciencias de la Salud con rea de

concentracin en Enfermedades Infecciosas.

BIOLOGA CELULAR
EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS.

Neurotoxinas botulnicas y el
botulismo.

Presenta: Jonathan Rodrguez Santiago

ANTECEDENTES.

Siglo VIII, Wrttemberg, Alemania: 400 casos de envenenamientos

alimentarios de 1793 a 1853, 150 muertes.

Blunzen o Saumagen, estmago de cerdo cocido relleno de

morcilla.
1802, advertencia pblica sobre el "consumo nocivo de salchichas
ahumadas".

Justinus Kerner.

1815. Reporto intoxicacin letal por alimentos

1820. Resumi los casos de 76 pacientes y dio una descripcin
clnica completa de los que actualmente se conoce como
botulismo.
1821. Kerner intensific sus actividades en la investigacin de la
toxina e inici con experimentos en animales y en l mismo.
ANTECEDENTES.

Hiptesis de Kerner:

la toxina se desarrolla en salchichas bajo condiciones

anaerbicas;
la toxina es una sustancia biolgica;
la toxina es letal incluso a pequeas dosis;
la toxina acta en el sistema nervioso motor y autonmico.

Kerner predijo la potencial utilidad clnica de la toxina, tanto en

condiciones de hipercontraccin muscular como condiciones
autonmicas de hipersecrecin glandular.
ANTECEDENTES.

1895, Ellezelles, Blgica;

34 personas desarrollaron sntomas de botulismo.

Emile Van Ermengem llev a cabo una examinacin detallada del jamn
contaminado y de cortes esplnicos provenientes de las autopsias de las
vctimas.

Van Ermengem aliment a ratones, cerdos y monos con macerado del jamn
contaminado, causando sntomas de botulismo y la muerte.

Realiz cultivos a partir del jamn y de las muestras de bazo, y logr aislar un
bacilo anaerobio esporulado, al que denomin Bacillus botulinus

Van Ermengem prepar filtrados de los cultivos, libres de bacilos y esporas, y los
administr a animales, reproduciendo los mismos signos de parlisis que
observ con el macerado y el cultivo mismo, demostrando as la existencia
de una toxina.
ANTECEDENTES.

1897;

Kempner fue el primero capaz de producir antitoxinas

neutralizantes en cabras, a partir de la cepa de Van Ermengem.

1904; Darmstadt, Alemania;

Un brote fue investigado por Landmann y Gaffky. Los alimentos

txicos en este brote eran frijoles blancos en conserva (primera
vez que se involucraban alimentos vegetales en el
botulismo).
ANTECEDENTES.

1919;

Georgina Burke estableci la designacin A y B de las toxinas

botulnicas usando cepas aisladas de brotes humanos de
botulismo en Estados Unidos.

1922;

Bengston reporta por primera vez el serotipo C de la BoNT.

Muestras provenientes de pollos con la enfermedad de cuello
flexible (limberneck), encontrando la presencia de una toxina con
un comportamiento anlogo a las toxinas A y B de Burke.

1929;
Gunnison y Meyer reportaron la toxina D en una cepa que
ocasion un brote de botulismo en cabras en Sudfrica.
ANTECEDENTES.

1936;
Gunnison et al. reportaron BoNT E. A partir de dos brotes
humanos por ingesta de pescado contaminado en Nueva york y
Ucrania.

1958;

Moller y Scheibel reportaron la toxina botulnica tipo F en la

investigacin de un brote de botulismo humano en Dinamarca
relacionado al consumo de pasta de hgado.

1968;
Lillian V. Holdeman y John B. Brooks dividieron la especie
Clostridium botulinum tipos A, B, C, D, y F dentro de tres
grupos metablicos.
ANTECEDENTES.

1970;
Gimnez y Ciccarelli describieron el serotipo G, aislado en
Argentina, fue encontrado en baja concentracin en muestras de
suelo y es asacaroltica y carente de actividad lipasa.

1974;
Se integra el serotipo G a un cuarto grupo.

1988;
CDC asla Clostridium baratii y Clostridium butyricum a
partir de pacientes con botulismo infantil, son potencialmente
botulignicas.
ANTECEDENTES.
MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.

Entrada en la circulacin

BoNT supera la barrera

epitelial intestinal

Se dispersan en fluidos
extracelulares y entran en el
sistema linftico y luego en
la circulacin sangunea

BoNTs no pueden
atravesar la barrera
hematoenceflica y, por lo
tanto, no pueden ingresar
al sistema nervioso central
(SNC).
 MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.

Las BoNTs slo se unen a las terminales nerviosas perifricas,

particularmente las de los nervios colinrgicos esquelticos y
autonmicos parasimpticos.
MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.
 MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.
1. Unin de doble BoNTs explota dos eventos fisiolgicos principales de
receptor. terminales nerviosos:
Enlace inicial (PSG)
la endocitosis de las vesculas sinpticas (para
Enlace funcional
entrar en las terminales nerviosas)
(Syt/SV2) el relleno de neurotransmisores de la vescula
sinptica (para entregar la metaloproteasa de la
2. Entrada a terminal cadena L al citosol).
nerviosa

3. Liberacin a citosol

4. Escisin de SNARE
MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.
 MECANISMO CELULAR DE LA TOXINA
BOTULNICA.
Mecanismo de neuroparlisis inducida por BoNT.

Las cadenas L de BoNT son metaloproteasas de SNARE:

VAMP (protena de membrana asociada a las vesculas o sinaptobrevina)

SNAP25 (protena asociada al sinaptosoma de 25 kDa)
Sintaxina.
EXPERIMENTACIN

Burgen et al. 1949

 EXPERIMENTACIN

La BoNT bloquea la liberacin de acetilcolina en la unin neuromuscular.

En 1949, Burgen y colaboradores:

Sumergieron una longitud de nervio junto con los electrodos estimulantes en un

compartimiento que no estaba en comunicacin con el bao principal y
adicionaron toxina, sin producir cambio en la contraccin del msculo

BoNT acta en la unin neuromuscular

 EXPERIMENTACIN

La BoNT bloquea la liberacin de acetilcolina en la unin neuromuscular.

En 1949, Burgen y colaboradores:

Despus de la parlisis inducida por la toxina botulnica, el msculo responda

normalmente a la estimulacin elctrica directa

No hay dao muscular.

 EXPERIMENTACIN

Dong et al 2006
Schiavo et al 1992
 EXPERIMENTACIN

Bloqueo de la liberacin del neurotransmisor de BoNT/B por escisin de

sinaptobrevina (VAMP).

1992, Schiavo y colaboradores.

Determinacin de componentes proteicos de vesculas sinpticas de corteza

cerebral de rata (electroforesis)

BoNT/B reducido:

decremento de sinaptobrevina (19K)

Aparicin de fragmentos de 12 y 7 K

BoNT/B + EDTA

Sinaptobrevina no se modifica

Escisin metaloproteasa
dependiente de sinaptobrevina.
 EXPERIMENTACIN

La BoNT bloquea la liberacin de acetilcolina en la unin

neuromuscular.

Agregaron acetilcolina al sistema, va inyeccin retrgrada en vena cava, de

manera que sta llegara a la unin sinptica.

Efecto sobre las contracciones

musculares al agregar 10 g de
acetilcolina a la vena cava

A) En el sistema contrctil normal sin

toxina botulnica

B) En el sistema con respuesta

contrctil al estmulo elctrico
disminuida a un 10-15% por efecto
toxignico

C) Cuando el msculo est totalmente

paralizado

bloqueo de la liberacin de
acetilcolina de las fibras
nerviosas motoras
 EXPERIMENTACIN

Bloqueo de la liberacin del neurotransmisor de BoNT/B por escisin de

sinaptobrevina (VAMP).

1992, Schiavo y colaboradores.

Determinacin de componentes proteicos de vesculas sinpticas de corteza

cerebral de rata (electroforesis)

La escisin de sinaptobrevina 19K es

parcial

7K: - FERSAAKLKRKYWWKNLKMMIILxV

Correspondiente a SYB-2

Sitio de accin proteoltica en enlace peptdico

Q76 F77
 EXPERIMENTACIN

Bloqueo de la liberacin del neurotransmisor de BoNT/B por escisin de

sinaptobrevina (VAMP).

1992, Schiavo y colaboradores.

Neuronas de ganglio bucal de Aplysia

californiana.

Introduccin de :

BoNT/B + ASQFETS

BoNT/B + QFET
 EXPERIMENTACIN

Dong et al 2006
 EXPERIMENTACIN

SV2 es el receptor de BoNT/A.

En 2006, Dong y colaboradores

Se conoca que estimular la liberacin de neurotransmisor reduca el tiempo

requerido para la parlisis causada por BoNT/A en el diafragma;

Induccin de potencial de accin con alta [K+] en preparacin de hemidiafragma y cultivos

de hipocampo de ratones, increment la unin de la BoNT/A a las uniones
neuromusculares (NMJs).

-BTX: marcador de NMJs

(se une a receptor de ACh).
 EXPERIMENTACIN

SV2 es el receptor de BoNT/A.

Syt INAb: etiqueta de fusin de

vesculas secretorias (Syt se encuentra
en el lumen de la vescula)

Syt INAb y BoNT/A se unen a las

mismas vesculas secretorias en la
cara luminal.

Sin Ca+ las vesculas no se liberan,

an con la despolarizacin de la
membrana con alta [K+], (Syt INAb
como BoNT/A no se unen a sus
protenas receptoras en la cara luminal
de las vesculas)
 EXPERIMENTACIN

SV2 es el receptor de BoNT/A.

Inmunoprecipitacin:

anti-SV2 coinmunoprecipit con BoNT/A

Anti-Syp (sinaptofisina) no coinmunoprecipit

con BoNT/A.
 EXPERIMENTACIN
SV2 es el receptor de BoNT/A.

Knockouts de SV2A y SV2B (las ms abundantes en cerebro) en neuronas de hipocampo de

ratones.

SV2B (-/-) inhibi ligeramente la unin de BoNT/A a las NMJs (figura 15A).
SV2A (-/-) inhibi casi completamente la unin de BoNT/A a las uniones NMJs (figura 15C).
Figura 15B: decremento de la expresin de SV2 y prdida de adhesin de BoNT/A a las
NMJs.
 EXPERIMENTACIN

Burgen et al. 1949

Dong et al 2006
Schiavo et al 1992
 DIAGNSTICO

Mtodos estndar (flechas negras).

Mtodos que apuntan al rastreo

inicial rpido (flechas grises).

Medidas destinadas a la
caracterizacin y obtencin de
informacin epidemiolgica (flechas
blancas).
 TRATAMIENTO

Ventilacin mecnica.

Tx con antitoxinas: suero equino trivalente (tipos A, B y E).

Inmunoglobulina humana antibotulnica para el tratamiento del

botulismo del lactante (<1 ao de edad).

Penicilina y metronidazol con resultados satisfactorios.

*La destruccin de C. botulinum en el intestino por antibiticos

puede aumentar la toxina libre en el botulismo del lactante.
 CONCLUSIONES Y PERPECTIVAS

Clostridium botulinum sigue una estrategia de supervivencia:

Letalidad (toxinas)
Esporulacin.

GAPs:

Detalles mecnicos de la endocitosis de la toxina en las vesculas

sinpticas
Translocacin de la cadena L a travs de la membrana de la
vescula sinptica y posterior liberacin al citosol.

Vacunacin:

Tiene como limitacin privar a la poblacin de los usos

benficos de las BoNTs;
baja incidencia de botulismo
extensos usos clnicos de las BoNTs,
No es costo-beneficiosa
 CONCLUSIONES Y PERPECTIVAS

Uso terapeutico de BoNTs

Estrabismo

Blefaroespasmo

Espasmo hemifacial

Distona cervical

BoNT e ingeniera gentica

Redireccin de la actividad cataltica de BoNTs a isoformas

SNARE no neuronales.

Modificacin gentica de las cadenas ligeras de la BoNT para

dirigirla a una SNARE no neuronal