HPLC

High Performance Liquid

Chromatography
CLAE
Cromatografia a Lquido de Alta Eficincia
1. Introduo
CROMATOGRAFIA = mtodo fsico de separao no qual
os constituintes de uma amostra a serem separados
so distribudos entre 2 fases:

estacionria:
estacionria geralmente de grande rea, slida ou
lquida
mvel: um fluido insolvel que percola atravs da
primeira
 FASE MVEL

Fase
estacionria
injeo separao eluio

DETECTOR
 CROMATOGRAFIA

SFC LC GC
Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrtico Lquido Gs

LC LC
Planar Coluna

CCD Coluna "Open

Cromatografia Coluna
Cromatografia Tubular" Capilar
Papel Empacotada
Camada Delgada dc < 350 um

Coluna Capilar Coluna Coluna Coluna

empacotada Microbore "Analtica" Preparativa
dc <= 350 um 350 um < dc < 1 mm 1 mm < dc < 8 mm dc >= 8 mm

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

LC Clssica

Fluxo por gravidade

HPLC Moderna*
Partculas da fase estacionria extremamente
pequenas (dimetro < 10 m) bombas para
operaes a altas presses (at 500 atm) e
baixas vazes (0,01 a 2-3 mL / min) ........High
Pressure LC

Solventes especiais e ultra-puros

Detectores seletivos e super-sensveis, com

tamanho de clula de deteco < 10 L
HPLC Moderna* Reservatrios para
Injetor os solventes

Precoluna

Bomba HPLC

Coluna Analitica

Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger
Substncias no analisveis por GC:
compostos inicos
sais inorgnicos e orgnicos
aminocidos puros
compostos polares de alto PM
polmeros
compostos termicamente instveis
corantes salinos
etc.
Aplicaes HPLC
Substncias qumicas
Protenas Compostos inicos
cidos nucleicos ons metlicos
Aminocidos Ctions e nions
Corantes Lipdeos polares
Polissacardeos Complexos metais
Pigmentos plantas pesados
Metablitos
plantas
Explosivos
Produtos
Polmeros
farmacuticos sintticos
 Vantagens da HPLC
Sensvel a diversas amostras, incluindo orgnicas,
biomolculas e ons - Pode-se analisar > 60% de todos
os componentes contra uns 15% para GC
Alta resoluo
resolve (separa) centenas de componentes em
amostras complexas
Deteco de alta sensibilidade
detecta nos limites de pg - ng

Anlises rpidas e precisas

anlises de 1 - 60 min, precio de 1% RSD

Anlises automatizadas
usando autosampler e sistema de tratamento de dados
4. Modos de Separao

Cromatografia de adsoro (slido-lquido)

Cromatografia de partio (lquido-lquido)
Cromatografia de troca inica
Cromatografia por excluso de tamanho
 Fase Estacionria
Slida
Apresenta na superfcie cargas inicas ou polares.

Exemplos:
Slica gel
Alumina
Florisil
Carvo
Carbonato de clcio
 Fase Mvel
Hexano
Isooctano
Cloreto de butila
Clorofrmio
Diclorometano
Tetraidrofurano
Acetonitrila
Iso e n-propanol
Metanol
gua
Cromatografia de
Adsoro

Fluxo
apolar
 Cromatografia de partio clssica
FASE ESTACIONRIA
Fina camada de lquido que cobre as partculas de um

suporte slido
Este lquido pode ser:

polar: polietilenoglicol, ODPN (, -oxidipropionitrila)

apolar: hexano

FASE MVEL
Sempre de polaridade contrria

Baixa estabilidade
 Cromatografia de partio com fases
quimicamente ligadas

FASE ESTACIONRIA
Lquido quimicamente ligado ao suporte

slido.

FASE MVEL
Sempre de polaridade contrria

Alta estabilidade
Fases polares quimicamente ligadas
frequentemente utilizadas
MODO GRUPO ESTRUTURA DO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO

Amino NH2

Ciano (nitrila) CN
FASE
NORMAL
Si O CH2 CH CH2OH

Diol O OH

Si O CH2 CH CH2OH

O OH
Fases apolares quimicamente ligadas
freqentemente utilizadas
GRUPO ESTRUTURA DO
MODO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO

CH3
Dimetil silil Si
CH3

Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3

FASE
REVERSA
Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3

Fenil silil Si OH
Cromatografia de Partio
apolar

Fluxo
polar
polar
 Cromatografia Fase Normal (NPC)
x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)
Classificao baseada na Natureza da Fase
Mvel
NPC
Fase mvel Apolar hexano, isooctano

Fase estacionria Polar slica, alumina

RPC
Fase mvel Polar metanol, gua

Fase estacionria Apolar C8, C18

 Portanto..........
GERALMENTE:

NPC Cromatografia Adsoro

RPC Cromatografia Partio

4.3. Cromatografia de troca inica

FASE ESTACIONRIA = grupos inicos quimicamente

ligados a um suporte (slica ou polmeros de alto PM).
Pode ser:
trocadora de ctions: grupo inico = sulfonato
trocadora de nions: grupo inico = amnia quaternria
FASE MVEL = solues tampes (controle pH). Por
exemplo: cido ctrico, fosfato amnia, acetato sdio,
borato sdio, etc.
APLICAES = compostos inicos, aminocidos,
protenas/peptdeos, etc
Cromatografia de troca inica

+
SO3- Na
Suporte
Polimrico pH
ou de Silica

Fluxo
- +
SO3 Na
4.4. Cromatografia por excluso de
tamanho
A separao baseada no tamanho da molcula e no em
fenmenos de interaes fsicas ou qumicas

FASE ESTACIONRIA = partculas com dimetro mdio de poro

fabricado sob medida. Assim, algumas molculas (menores)
podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros mdios, ou
seja, so permeadas seletivamente. As molculas grandes so
excludas excluso tamanho.
Cromatografia por excluso de
tamanho
FLUXO

Gel

Poro
Resoluo (Rs)
Rs = tr1 - tr2 / wb
Rs = separao real dos picos
Rs = 0 (sem separao), Rs = 1
(separao parcial), Rs = 1.5
(separao da linha base)
t

Injeo
W W
 1. Colunas
Sistema separao (adsoro, partio, etc)
Comprimento (10-25 cm)
cromatografia rpida 3 cm
Dimetro interno*
Tipo de suporte (slica gel ou polmeros)
Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8,
C18, sulfonato)
Tamanho da partcula (3-20 m)
Tamanho do poro (60-300 )
Dimetro da coluna

Tipo de Coluna i.d. Capacidade de Velocidade

(mm) amostra de Fluxo
(mg) (mL/min)
Semi-preparativa 8-20 10-50 5-30

Analtica 4.6 1 1

Narrowbore 2.0 0.2 0.2

Microbore 1.0 0.05 0.05

2. Bombas / Fase Mvel

Velocidade fluxo
0,1-3,0 mL/mim para colunas analticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativas

Presso operao
500-2000 psi para colunas analticas
Eluio Isocrtica /
Gradiente

ISOCRTICA = a composio da fase mvel

no muda durante a corrida.

GRADIENTE = a composio da fase mvel

varia de acordo com a polaridade dos analitos.
Bomba binria/quaternria.
3. Injeo da Amostra
INJETOR MANUAL

Da
Da
bomba
bomba
Amostra
da seringa
Para
Para coluna coluna

Descarte

Loop
Loop
3. Injeo da Amostra
AUTOSAMPLER
Corpo Solvente
da
Seringa
Amostragem
da Seringa

Vlvula de
injeo

Vials na bandeja
Frasco de lavagem
4. Detectores
Equipamento com uma pequena clula de
fluxo conectado na sada da coluna e que
monitora a concentrao dos analitos.

Detectores mais comuns:

UV/Vis (absorvncia)
Fluorescncia

ndice de Refrao
Outros: Eletroqumico, Condutividade,
Infravermelho, etc.
4.1. Detectores UV/Vis e Rede de
Diodos (DAD)
PRINCPIO: quando vrios grupos funcionais so
expostos radiao, sofrem excitao eletrnica a
qual resulta na absoro de energia em comprimentos
de onda especficos para os grupos.
Comprimento onda: 210-380 nm UV
Comprimento onda: 380-800 nm Visvel
90% compostos orgnicos absorvem luz em algum
lugar da regio UV-Vis
65% das amostras analisadas por LC absorvem luz
na regio de compr. Onda = 254 nm
Detector de Absorvncia UV/Vis
Detector de Rede de Diodos (DAD)
4.2. Detectores de Fluorescncia

Detectam compostos
com fluorescncia
natural (aflatoxinas)
ou que se tornam
fluorescentes aps
reao de derivao
(cloreto dansyl,
fluorescena, OPA)
4.3. Detectores de ndice de Refrao (IR)
PRINCPIO: mede a mudana do ndice de refrao
dos efluentes das colunas
IR : caracterstica fsica de cada composto
IR da substncia analisada IR da fase mvel
Anlise isocrtica, controle temperatura
Detector universal, no seletivo e pouco sensvel
Aplicaes: separaes preparativas, cromatografia
polmeros (excluso tamanho), acares, etc.
Detector de ndice de Refrao (IR)
 Detectores
SENSIBILIDADE
Fluorescncia: 1.000 vezes mais sensvel que
UV-Vis
UV-Vis: 1.000 vezes mais sensvel que IR

ESPECIFICIDADE
Aumenta com a sensibilidade
FIM !!!!!!!!!