Você está na página 1de 21

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
LABORATRIO DE BIOQUMICA EXPERIMENTAL-
LABIOEX

Avaliao da viabilidade celular pela


tcnica do MTT

Ms. Karina Bettega Felipe

Florianpolis, maio de 2011


1. Princpio
2. Amostra
Clulas aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar
aps o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.
3. Reagentes/solues/suspenso celular
Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose
suplementado com soro fetal bovino (10%) e soluo de
antibiticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina
10.000g/mL (1%);
Soluo de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL
Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de
meio de cultura completo
Suspenso celular na concentrao de 0,5X105 clulas/mL
4. Procedimento
Preparar uma suspenso celular na concentrao de
0,5X105 clulas/mL:
a) Retirar o meio de cultura da garrafa
b) Lavar a garrafa com PBS

c) Adicionar a tripsina
d) Esperar a tripsina reagir

e) Preparo do meio de inativao


f) Inativar a tripsina

g) Diviso do contedo da garrafa em dois tubos falcon


h) Centrifugar as clulas

i) Retirar meio com tripsina


j) Ressuspender as clulas em meio simples
k) Contar as clulas

N cls/mL= n cls
contadas/4 x diluio da
cmara X diluio amostra
N cls /mL=n cls
contadas/4 x 104 X 10
l) Preparar suspenso 0,5 X105 clulas por mL
-200 l/ poo X 96 poos = 19,2 mL
- Contagem de clulas: 5 X 105 clulas/mL
-Nmero de clulas necessrias:
0,5 X105 clulas 1000l
X - 19200l
X= 9,6 X105 clulas
- Quantos l da suspenso celular ter 9,6 X105 clulas?

5 X105 clulas 1000l


9,6X105 clulas- X
X= 1920l
5 X105 clulas 1000l 100l (0,5 X105 clulas) 1000l
0,5 X105 clulas - X X - 19200l
X= 100l X= 1920

- Suspenso utilizada para o teste:


- Precisaremos de 19.200l 1920l de soro
192l de antibitico
1920l da suspenso celular
15168l de meio
Preparo da suspenso celular

Adicionar 200l da suspenso celular em cada poo


24h

Retirar o meio de cultura 24, 48 ou


72 h

TRATAMENTO
Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 g/mL)

200L 1000L 1000L 1000L

Soluo me 100g/mL 50g/mL 25g/mL 12,5g/mL


(1000g/mL) 1800L meio 1000L meio 1000L meio 1000L meio

1000L

1000L

3,125g/mL 6,25g/mL

1000L meio 1000L meio


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125

CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125

CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125

H
24h

Retirar o meio de cultura 24, 48 ou


72 h

TRATAMENTO
O que vocs vo fazer!!!
Preparar Retirar o Lavar os
soluo meio poos 2X
MTT com PBS

Adicionar
5 DMSO

2h
Estabilizao
da cor 5 540 nm
Preparo da soluo de MTT (0,5mg/mL)
a) Preparo da soluo estoque a 5mg/mL
- Pesar 5mg de MTT
- Solubilizar em 1,0 mL de PBS estril.
b) Preparo da soluo de uso (0,5mg/mL)
CV=CV
5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL
V= 1mL da soluo estoque
+ 9 mL de meio completo

900l de soro + 90l de antibitico + 8010l de meio


O que vocs vo fazer!!!
Preparar Retirar o Lavar os
soluo meio poos 2X
MTT com PBS

Adicionar
5 DMSO

2h
Estabilizao
da cor 5 540 nm
Clculos

Descontar o branco !
Considerar o controle como 100% de
Fazer a mdia da
clulas viveis e fazer regra de trs para
absorbncia
determinar a viabilidade celular das
amostras