Click icon to add picture

Kromatografi Cair Vakum (KCV)

Wahyuni
 Kromatografi Cair Vakum
KCV merupakan salah satu cara metode fraksinasi yaitu dengan
memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih
sederhana.

Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fase diam

dan aliran fase geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silica gel atau aluminium
oksida.
 KCV dilakukan untuk memisahkan golongan
senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan
menggunakan silic gel sebagai absorben dan
berbagi perbandingan pelarut n-heksan : etil
asetat : methanol (elusi gradient) dan
menggunakan pompa vakum untuk memudahkan
penarikan eluan (Helman, 1983)
.
KCV merupakan salah satu jenis
kromatografi kolom. Kromatografi kolom
merupakan suatu metode pemisahan
campuran larutan dengan perbandingan
pelarut dan kerapatan dengan
menggunakan kolom. Kromatografi
kolom lazim digunakan untuk
pemisahan dan pemurnian senyawa
Fase diam yang digunakan dikemas dikemas dalam kolom yang
digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fase diam dslam kolom
terbagi menjadi dua yaitu:

A. Cara basah
Preparasi fase diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fase
diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian
dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan
mengalir terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran
dihentikan( Sarker et al.,2006)
B. Cara kering
Preparasi fase diam dengan cara kering dilakukan dengan cara
memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi.
Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan
digunakan.
Prinsip KCV
Prinsip kerja KCV adalah adsorbs atau serapan,
sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-
senyawa yang akan dipisahkan terdistribusi di antara
fase diam dan fase gerak dslm perbandingan yang
berbeda-beda.

Prosedur KCV menggunakan alat bantu yang berupa

pompa vakum untuk mempercepat laju alir fase gerak
selama poses pemindahan zat terlarut.
 Proses penyiapan fase diam :

Cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam

pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak. Larutan
dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fase
diam. Bagian atas sampel ditutupi dari sampel kembali dengan
fase diam yang sama.
Cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan
sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga
terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom
yang telah terisi dengan fase diam dan ditutup kembali dengan
fase diam yang sama.
 Pelarut untuk KCV

Pelarut yang kepolarannya paling rendah sampai pelarut yang

kepolarannya tinggi. Elusi diawali dengan pelarut yang
kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatan perlahan-
lahan sehingga (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa
komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan
tingkat kepolarannya. Oleh karena itu KCV menggunakan
tekanan yang rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak.
 Urutan pelarut yang
digunakan

Frak Pelarut Komposi Volume

si si (ml)
1 Heksana 100 100
2 Heksan-etil asetat 50:50 100
3 Etil asetat 100 100
4 Etil asetat- 72:25 100
methanol
5 Etil asetat- 50:50 100
methanol
6 Etil asetat- 25:75 100
methanol
7 Methanol 100 100
 Jenis-jenis KCV

1. Suction Colom
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak. Berdasarkan absorbs dan npartisi,
dimana kolom diisi dengan fase diam dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa
vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponenj kimia yang selanjutnta keluar sebagai
fraksi- fraksi
2. Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorbs dan partisi, dimana
kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat
turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi
3. Press Colom
Kromatografi kolom sederhana dimana fase gerak bergerak dengan cepat karena
penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogen. Udara yang ditekan mengandung O2 dan
uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat
pemisahan kromatografi.
 Penyiapan kolom

a. Dibersihakn kolom dan dibilas dengan methanol

b. Dipasang kolom tegak lurus pada statif
c. Dikemas fase diam di dalam kolom dengan keadaan
vakum, agar kerapatan yang maksimum
d. Dimasukkan adsorben silica gel G80 sebanyak 100
gram (atau sesuai kapasitas kolom yang digunakan)kle
dalam kolom dan dimampatkan
e. Diratakan permukaan adsorben dengan batang
pengaduk
f. Dialirkan n-heksan bebrapa kali dalam keadaan vakum
 Isolasi sampel

1. Ditimbang fraksi sebanyak 1 gram (atau sesuai jumlah fqse diam berdasarkan
perbandingan 1:100)
2. Dimasukan silica gel dengan perbandingan 30:10 (kasar:halus) kemudian diratakan
permukaannya
3. Dimasukan kertas saring untuk mencegah pengotor dalam cairan pengelusi
4. Dimasukkan n-heksan untuk menempatkan silica gel yang ada didalam kolom
5. Ditambahakan fraksi yang telah disuspensikan dengan silica gel kedalamm kolom
6. Ditambahakan cairan pengelusi dari kepolaran terendah n-heksan:etil asetat (10:0)
melalaui dinding kolom dan pompam vakum dijalankan hingga eluan turun dan
mengelusi komponen kimia.
7. Dilanjutkan dengan eluen turun dan mengelusi komponen kimia
8. Dilanjutkan dengan penyari yang kepolarannya lebih tinggi secara berturut-turut
(9:1, 8:1, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 dan 0:10)
9. Ditampung cairan sebagai fraksi
 Proses penyiapan fase diam

Cara basah
Preparasai fase diam dengan cara basah dilakukan dengan
melarutkn fase diam dalam fase gerak yang akan digunakan.
Campuran kemudian dimasukan ke dalam kolom dan dibuat
merata. Fase gerak dibiarkan dibiarkan mengalir hingga terbentuk
lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan
Cara kering
Memasukan fase diam yang digunakan langsung ke dalam
kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan
pelarut yang akan digunakan.
 Fraksinasi

Kromatografi Cair Vakum

merupakan salah satu metode
fraksinasi yaitu dengan
memisahkan crude extract
menjadi fraksi-fraksinya yang
lebih sederhana.
Fraksinasi dengan KCV
Keuntungan KCV

1. Konsumsi KCV fase gerak hanya 80% atau lebih kecil

disbanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
l/menit)
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer
massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih
pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas.
Kerugian KCV
1. Membutuhkan waktiu yang cukup lama
2. Sampel yang dapat digunakan terbatas
 Komposisi pereaksi dalam KLT

1. Perekasi Asam perklorat 20 % :

Asam perklorat, HClO4 60% 60 ml
Aquadest 133 ml
Mayer

HgCL2 1,358 g
Aquadest 60 ml
KI 5g
Aquadest 10 ml
Dilarutkan 1,358 g merkuri (II) klorida dengan 60 ml akuades (larutan A).
Dilarutkan 5 g kalium iodida dengan 10 ml akuades (larutan B). Dituangkan
larutan A ke dalam larutan B, diencerkan dengan akuades sampai volume
larutan menjadi 100 ml (Mulyono, 2009).
2. Amonium Hidroksida 3N
Dilarutkan 102 ml ammonium hidroksida pekat sedikit demi sedikit dengan 400 ml akuades,
kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca berwarna gelap dan ditutup rapat (Mulyono, 2009).
3. Asam Klorida 3 M ; 3 N
Dimasukkan 260 ml asam klorida pekat secara perlahan ke dalam erlenmeyer yang berisi 740
ml akuades, kemudian dimasukkan ke dalam botol reagen gelap dan ditutup rapat (Mulyono,
2009).
4. Asam Sulfat 3 M ; 6 N
Dimasukkan 170 ml asam sulfat pekat secara perlahan ke dalam erlenmeyer yang berisi 830 ml
akuades, kemudian dimasukkan ke dalam botol reagen gelap dan ditutup rapat (Mulyono,
2009).
5. Fehling
Dimasukkan asam sulfat pekat sebanyak 5 ml secara perlahan ke dalam
erlenmeyer yang berisi 100 ml akuades sambil sesekali diaduk, kemudian
dimasukkan kupri sulfat pentahidrat 34,66 g ke dalamnya. Setelah larut,
diencerkan dengan akuades sampai volume larutan menjadi 500 ml.
dipindahkan pereaksi ini ke dalam botol reagen coklat dan ditutup rapat
(disebut fehling A; berwarna biru). Dilarutkan natrium hidroksida sedikit
demi sedikit sebanyak 50 g ke dalam 250 ml akuades, kemudian
dilarutkan garam kalium natrium tartrat sebanyak 173 g ke dalam larutan
tersebut sedikit demi sedikit sampai larut. Ditambahkan akuades ke dalam
campuran larutan tersebut hingga volume larutan menjadi 500 ml.
(disebut fehling B; tak berwarna). Dicampurkan Fehling A dan Fehling B
dengan perbandingan volume yang sama pada saat akan digunakan
(Mulyono, 2009).
6. Natrium Hidroksida 3 M ; 3 N
Ditimbang 63,2 g natrium hidroksida dengan menggunakan gelas arloji lalu
dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan akuades sebanyak 50 ml
dan diaduk hingga melarut. Dimasukkan ke dalam botol reagen gelap, lalu
diencerkan volume larutan sampai volumenya menjadi 500 ml dan ditutup
rapat (Mulyono, 2009).
7. Timbal (II) Asetat 0,5 M ; 1N
Dilarutkan sedikit demi sedikit 95 g timbal asetat ke dalam 200 ml
akuades, kemudian ditambahkan akuades sampai volume larutan menjadi
500 ml (Mulyono, 2009).
8. Ferri Klorida 0,5 M ; 1,5 N
Dimasukkan 10 ml asam klorida pekat secara perlahan ke dalam erlenmeyer yang
berisi 40 ml air, kemudian dilarutkan sedikit demi sedikit ferri klorida sebanyak 67,6
g, kemudian ditambahkan akuades sampai volume larutan menjadi 500 ml
(Mulyono, 2009).
9. Vanilin-asam sulfat
Vanilin 1g
Asam sulfat pekat 100 ml
10. Liberman Burchard
Asam asteta anhidtat 5 ml
Asam sulfat pekat 5 ml
Etanol 50 ml
Cara pembuatan : Dilarutkan sedikit demi sedikit sebanyak 4 g kalium iodida
ke dalam akuades hingga larut kemudian ke dalam larutan dilarutkan sedikit
demi sedikit 2 g iodium hingga larut. Dicukupkan volume larutan hingga 100
ml (Mulyono, 2009).
11. Dragendoft- HCL

Bismuth nitrat300 mg
Asam klorida 25 %
Aquadest 5 ml
KI 3 g
Aquadest 5 ml
Cara pembuatan : Ditimbang bismut (III) nitrat sebanyak 0,8 g dan dilarutkan dalam 20 ml asam
nitrat pekat. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 50
ml akuades, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna.
Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan akuades sampai 100 ml (Mulyono, 2009).
12. Bouchardat
Iodium 2 bagian
KI 4 bagian
Aquadest 100 ml
Dilarutkan sedikit demi sedikit sebanyak 4 g kalium iodida ke dalam akuades
hingga larut kemudian ke dalam larutan dilarutkan sedikit demi sedikit 2 g
iodium hingga larut. Dicukupkan volume larutan hingga 100 ml (Mulyono,
2009).
Thank you
Semoga bermanfaat