Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias

Carrera Ingeniera en Biotecnologa

PRINCIPIOS DE GENTICA MOLECULAR

Enzimas que participan.

Replicacin del DNA en
Procariontes
Ing. Isabel Baroja Oviedo, M. Sc.
 SUMARIO

Enzimas que participan en el proceso

Sntesis del DNA en la horquilla de replicacin

Etapas de la replicacin

Pasos y eventos de la replicacin en

procariontes
Control de la reiniciacin en procariontes

Bibliografa:
Captulo 9: The Replication of DNA. Molecular
Biology of the Gene. Watson et al., 2013. Pg. 257.
Modelo del Replicn
Secuencia de DNA en cis
Inicia la replicacin
Origen de replicacin es parte
del REPLICADOR
Es una protena que reconoce
al replicador
Activa la replicacin
Es la nica protena que se une
al replicador, las otras hacen
con uniones protena-protena
Secuencias replicadoras
Asociacin de la
maquinaria
de replicacin
Protena Iniciadora
Flujo de la Replicacin
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
INICIACIN
En la siguiente tabla se resumen las funciones de
las protenas requeridas para iniciar la replicacin:

Protena PM # Funcin
(kD) Sub
Dna A 50 1 Abre el dplex en un sitio
especfico
Dna B 300 6 Desenrolla el DNA
Dna C 29 1 Requerida por Dna B
HU 19 2 Histonas. Estimulan la iniciacin
Primasa 60 1 Sntesis de cebador
SSB 75 4 Se une al DNA se facilita actividad
de DnaA
RNA 454 6 Facilita actividad de Dna A
Polimerasa
Flujo de la Replicacin
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
HOLOENZIMA:
Nombre general para un complejo de multiprotenas en la cual
una actividad enzimtica central se asocia con componentes
adicionales que potencian esa funcin.
En E. coli incluye dos copias de DNA pol III y una copia de la
protena abrazadera.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
Cmo es que ambas polimerasas permanecen unidas a
ambas cadenas en la horquilla de replicacin?

Se ha planteado un modelo para explicar como

funciona.
Basado en la flexibilidad del DNA.
Modelo de trombn
La cadena
retardada que se
va sintetizando
forma un bucle.
Cuando se
termina un
fragmento de
okasaki se suelta,
asemejando el
movimiento del
http://www.youtube.com/wat
asa de un
ch?v=4jtmOZaIvS0
trombn.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
PROCARIONTES: Adicionalmente, otras
interacciones protena-protena permiten el rpido
avance de la horquilla de replicacin.

DNA helicasa- holoenzima DNA helicasa- Primasa

DNA Pol III
Esta interaccin fuertemente asociada a la
incrementa el movimiento
de la helicasa hasta 10
veces.
Cuando se separa la
helicasa se baja su
velocidad.
La primasa no est
horquilla de replicacin.
Solo se asocia con la
helicasa y el DNAss cuando
va a sintetizar un primer.
Cuando interactan ambas
enzimas se estimula la
funcin de la primasa
hasta 1000 veces.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
Interaccin DNA helicasa - holoenzima DNA Pol III
hace que la helicasa no vaya ms adelantada de la
horquilla de replicacin, por lo que sirve para coordinar
las dos pol. en ambas horquillas de replicacin.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
Interaccin DNA helicasa- Primasa adems es importante
para regular la longitud de los fragmentos de Okasaki.
El incremento se su actividad hace que sintetice ms
primers y por tanto fragmentos de Okasaki ms cortos.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
La combinacin de todas las protenas que
funcionan en la horquilla de replicacin se
conocen como REPLISOMA: Holoenzima DNA
Pol, helicasa y primasa.

ste es una fbrica finamente regulada para la

sntesis de DNA donde la actividad de cada
protena es altamente coordinada, que
tambin se ha encontrado en Eucariontes.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
Este replisoma no existe como una unidad
independiente (como el ribosoma por ejemplo), solo
aparece como complejo asociado a la horquilla de
replicacin

En la tabla se listan los factores que lo componen y sus

funciones anlogas en bacterias, levaduras y humanos.
 Sntesis del DNA en la horquilla de
replicacin
Su accin coordinada determina la
eficiencia de la replicacin. Ej. E. coli:
El replisoma puede moverse a ms de 600 Km/hora.

La repliacin del genoma de E. coli puede hacerse en 40

minutos, equivalente a recorrer 400 Km.

Ms asombroso, durante ese recorrido comete solo un

error como promedio.
Etapas de la replicacin
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
INICIACIN
El origen de replicacin es nico en procariontes y
casi todos los virus.

http://www.youtube.com/watch?v=HBwyNrkYnp0
 Unidades de replicacin
Procariontes

En el genoma de procariotas existe un nico

replicn.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
INICIACIN
La secuencia se conoce como
origen de replicacin (ORI), que
va a ser reconocida por una
protena.
Protena iniciadora:
Reconoce especficamente la
secuencia del ORI.
Abre el DNA.
Recluta las protenas que
constituyen la maquinaria de
replicacin.
 Etapas de la replicacin
REPLICADOR:
PROCARIONTESSecuencias de DNA
con accin cis,
INICIACIN suficiente para dirigir
el inicio de la
Intervienen dos replicacin.
componentes:
replicador e
iniciador, para INICIADOR: Protenas
iniciadoras que
controlar el inicio reconocen el sitio del
de la replicacin. DNA y activan el inicio
de la replicacin.

En E. coli el nico
replicador que
hay se llama OriC
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
Origen de replicacin (ORI) REPLICADOR
Sitio fsico del DNA Secuencia especfica
donde se desenrolla el reconocida por el
DNA y se abren las Iniciador.
cadenas para iniciar la Compuesta por:
sntesis. Sitio de unin a
No siempre incluye la protenas para acoplar el
iniciador y la maquinaria
secuencia completa para
de inicio de la
el iniciador (ej. replicacin.
Eucariontes)
Tramos de DNA ricos en
A-T para facilitar la
apertura.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
INICIACIN
Una vez que el
iniciador se une al
replicador le sigue el
reclutamiento de las
protenas que
interactan entre ellas,
o con el DNA.
El resultado es el
ensamblaje de dos
replisomas.
INICIACIN
PRIMOSOMA
La longitud de la
doble hlice
desenrollada para
iniciar la
replicacin es
probablemente
menor de 60
bases.
El DNA de simple
cadena es
estabilizado por las
protenas SSB.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
Control de la reiniciacin en procariontes

Inmediatamente despus En los 245 pb de oriC hay

de la sntesis el DNA queda 12 secuencias GATC
en un estado conservadas.
hemimetilado: Estas secuencias son
sustrato de la enzima Dam
Cadena parental
metilasa, que introduce
metilada
un grupo metilo en una A
Cadena nueva no (dam = deoxyadenosin
metilada metilasa) de la secuencia
GATC.
Una vez que se inicia una Tambin conocidas como
ronda, no debe iniciarse Dam metiltrasnferasas
otra hasta pasado un
tiempo T.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
Control de la reiniciacin en procariontes

Dam metilasa Durante estos dos

minutos el DNA
Requiere que DNA
hemimetilado (una hemimetilado acta
banda metilada y la como seal de
otra no). reparacin.
La Dam metilasa no
acta inmediatamente,
sino que tarda unos 2
min. en metilar la
hebra complementaria.

Este tiempo lo usa el

sistema de reparacin.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
Control de la reiniciacin en procariontes

El estado hemimetilado
del DNA de OriC lo
identifica la protena
SeqA.
Los sitios GATC son
abundantes dentro y
cerca del OriC.
Una vez que se inicia la
replicacin, SeqA se une
a todos estos sitios para
que NO puedan ser
metilados por la Dam
metilasa.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
Control de la reiniciacin en procariontes

Efectos de SeqA:
Reduce la tasa de
metilacin de los sitios
GATC.
Previene la unin de
DnaA al OriC y por
tanto que se inicie otra
nueva ronda de
replicacin.

Cuando se disocia
SeqA se metila el
DNA.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
ALARGAMIENTO
El alargamiento tiene lugar cuando la DNA
polimerasa III se incorpora al complejo de
iniciacin, formndose el replisoma.
La polimerasa
en la cadena
adelantada
permanece
unida a una sola
pinza durante
la replicacin.
En la cadena
retardada se
une y recicla la
pinza a la
polimerasa
durante la
replicacin.
 Continuar animacin 8- Replicatio

Los cebadores (fragmentos de

RNA) deben ser remplazados
por los correspondientes
fragmentos de DNA. Esta
funcin es llevada a cabo por
la DNA polimerasa I
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
TERMINACIN
Terminan cuando se encuentran en un punto
diametralmente opuesto a OriC (de donde partieron), donde
se desensambla el complejo de replicacin.

Existen adems sitios especficos de terminacin, los

llamados sitios Ter, que garantizan que ambas horquillas se
encuentren si ocurre algn retraso de una con respecto a la
otra.
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
TERMINACIN
En E.coli se han
encontrado 6 sitios Ter.
Secuencias consenso de
23 pb que son reconocidas
por la protena Tus
(Terminus Utilization
Substance).
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
TERMINACIN
Cada sitio Ter es asimtrico y puede interactuar con
una protena Tus.
La protena Tus detiene el movimiento de la
horquilla de replicacin solo en una direccin:

Adapted from Hidaka, M., Kobayashi, T., and

Horiuchi, T. J.Bacteriol. 173:381, 1991
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
TERMINACIN
La unin de la protena Tus a la secuencia
consenso frena a la horquilla de replicacin
correspondiente mediante una actividad contra
helicasa (inhibe a la DnaB).
 Etapas de la replicacin
PROCARIONTES
TERMINACIN
Una vez replicado el
cromosoma ambos
dplex quedan
entrelazados, o sea,
se forman catenados
que deben ser
separados por la
Topoisomerasa II.