UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE

MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
ZARAGOZA
Qumica Farmacutica Biolgica

Microbiologa General I

Cuantificacin de microorganismos: mtodos

directos

Grupo: 2652
Asesor: QFB Yolanda Flores Cabrera
Presentan:
Mara
Carolina
Brenda
Pacheco Rodrguez M. ngel.
Navarrete Bejarano Jess Daniel.

Ciclo escolar 2017 II

 Introduccin.

Los mtodos directos de cuantificacin de

microorganismos permiten establecer la poblacin
total de microorganismos existentes.
Hay mtodos que cuantifican el numero de clulas y
otros que cuantifican la masa total
Conteo de microorganismos.
RECUENTO EN PLACA POR FILTRO DE
MENBRANA
La muestra pasa a travs de una membrana porosa que
retiene a los microorganismos y que posterior mente se
coloca en una placa.
Se basa en la suposicin de que cada bacteria o agrupacin
de colonia crece y se divide para formar una sola colonia

VENTAJAS DESVENTAJAS
MIDE EL NO. DE REQUIERE BASTANTE
CLULAS VIABLES TIEMPO (24 HRS O MS)
LAS BACTERIAS CRECEN
EN UNIDAD, EN
CADENAS O COMO
GRUMOS
 CMO SE CUENTAN LAS COLONIAS
POR VACIADO EN PLACA?

El mtodo mas usual para contar para realizar el conteo de

clulas viables se basa en contar el numero de clulas de
una muestra que es capaz de formar colonias al sembrarlo
en un medio adecuado
Mtodo de extensin en placa
Mtodo vertido en placa (o diluciones)
 RECUENTO EN PLACA
VENTAJAS DESVENTAJAS
MIDE EL NO. DE CLULAS REQUIERE BASTANTE
VIABLES TIEMPO (24 HRS O MS)
MICROORGANISMO
SENSIBLES AL CALOR LAS BACTERIAS CRECEN EN
PUEDEN RESULTAR UNIDAD, EN CADENAS O
DAADOS POR EL AGAR COMO GRUMOS
FUNDIDO

SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA

VENTAJAS DESVENTAJAS
MIDE EL NO. DE CLULAS REQUIERE BASTANTE
VIABLES TIEMPO (24 HRS O MS)
MICROORGANISMO
SENSIBLES AL CALOR LAS BACTERIAS CRECEN
PUEDEN RESULTAR EN UNIDAD, EN CADENAS
DAADOS POR EL AGAR O COMO GRUMOS
FUNDIDO
EN MEDIOS
DIFERENCIALES LAS
COLONIAS QUE SE
FORMAN DEBAJO DE LA
SUPERFICIE NO SON
ADECUADAS (SLO LAS
En el mtodo de
vertido en placa

Las muestras
diluidas se
mezclan con agar
fundido y se
vierten en placa.

Algunas colonias
quedarn
embebidas en el
agar y otras
crecern en la
superficie.

Las colonias
superficiales se
extendern y
sern ms
grandes.
 DILUCIONES SERIADAS
Una dilucin en serie es la reduccin progresiva,
paso a paso, de la concentracin de una sustancia
en disolucin.
VENTAJAS DESVENTAJAS
AFECTA EL NO HACER BIEN LAS
ES FCIL
DILUCIONES
NO HOMOGENIZAR BIEN LA MUESTRA
NO CUENTA ANAEROBIOS
NO CUANTIFICA BACTERIAS
EXIGENTES NUTRIONALMENTE
NO CONTAR CORRECTAMENTE
 Mtodo de la gota o de Miles-Misra.
Fundamento

El mtodo de Miles y Misra o conteo variable en superficie se basa

en calcular el nmero de unidades formadoras de una colonia en una
suspensin bacteriana. Fue descubierto por Miles y Misra en 1938.
Adems es un medio de conteo que mediante cultivo de la muestra,
se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se parte
de un volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la
procedencia de la muestra se puede esperar la obtencin de cuentas
bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se esperan pocos
microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se
esperan cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades
conocidas del diluyente, utilizando solucin salina, agua peptonada u
otros.
Procedimiento

Se preparan una serie progresiva de diluciones en serie de la

suspensin bacteriana original, tantas como sean necesarias.
Los materiales necesarios son una micropipeta correctamente calibrada
que pueda surtir gotas de 0.02ml y 6 placas de agar nutritivo. Estas
placas se dividen en sectores numerados.
La suspensin o dilucin se coloca en forma de gotas (0.02ml) desde
una altura de 2,5 cm; sta se dispersar aproximadamente en un rea de
1.5 a 2.0 cm de dimetro.
Cada una de las 6 placas tendr una gota de cada dilucin en el sector
correspondiente (numerado)
Periodo de incubacin: 18-24 horas. Posteriormente, se observa su
crecimiento.
.Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC. El
nmero de bacterias viables se obtiene calculando la media de cada
dilucin en las repeticiones realizadas.
El nmero de bacterias viable por 0.02ml de una dilucin se obtiene
calculando la media de los contajes para cada dilucin en las 6 placas.
 Tomando el ejemplo tenemos que:
0.02 mL 3 UFC
1 mL - X
Formula para X = (3 *1) /0.02

calcular UFC. = 150 UFC/mL= 1.5 x 102 UFC/mL

S la muestra fue de una dilucin
Nm. de bacterias/ 1/100
(ml.)=NxF/V
tendramos:
150 UFC*100 UFC/mL
1.5 x 10^4 UFC/mL
 Asa calibrada.
Es un mtodo de cuantificacin de microorganismos
directo viable.
Este mtodos se basa en poner en evidencia la
presencia de los microorganismos vivos.
Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la
interpretacin de resultados.
Se emplean medios de cultivo generales,
enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo
de los microorganismos a cuantificar.
La utilizacin de agujas o asas calibradas permite tomar volmenes
pequeos, que son inoculados en la superficie del agar mediante la
tcnica de siembra masiva.

Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilucin del

asa empleada. El uso ms frecuente de est mtodo es en el
urocultivo. Se determinan las UFC/g o mL de muestra.
 Mtodo de Bred.

Es un mtodo para el conteo de microorganismos totales, tanto de los

microorganismos vivos y los no vivos.
Se utiliza principalmente en muestras de leche.

Para su conteo:
Muestra a evaluar (directa o diluida)
Microscopio
Objetivo micromtrico
Asa calibrada o micropipeta
Portaobjetos
Colorantes de Gram u otros colorantes.
A
10mL
teir
1 cm
2 cm

rea de la muestra= bxh

y convertir a mm2 Observar 10 campos, contar
las bacterias de cada uno de
ellos y obtener el promedio X
B
C Factor= Am/Ac D

D Calcular el nmero de bacterias por

mL
Determinar el rea del X x Factor x 100 = bacterias_____ /mL
campo: A= pxr2 (mm2 ) 100 es la dilucin inicial al tomar
0.01mL
1mL = 1000mL
1cm = 10 000mm
EXTRA. Uso del equipo micromtrico
 Cmaras de conteo.

Las cmaras de recuento son portaobjetos

excavados modificados, su superficie esta marcada
por una rejilla con pequeos cuadros de rea
conocida. Se utilizan para contar el nmero de
clulas por unidad de volumen de suspensin
bacteriana.
 Cmara de Neubauer:

Es un dispositivo de precisin
hecho de vidrio ptico especial. Se
utiliza para contar clulas u otras
partculas en suspensin es bajo el
microscopio.
Imagen 1. Esquema que indica la profundidad de la cmara

Imagen 3. Pila de
Imagen 2. Cmara de
cubreobjetos, y caja.
Neubauer comercial
 Imagen 4. Dimensiones de la cuadrcula cuadro
principal.

Cuadro central

Imagen 5. Pipetas Thoma

a. pipeta con muestra hasta la
marca 0.5
b. con el diluyente correspondiente
hasta la marca final
 Imagen 6. Para llenado. Colocamos la pipeta en el borde del cubreobjetos y
la cmara teniendo cuidado de no mover el cubreobjetos.

Imagen 7. Conteo de un Imagen 8. Recuento con

cuadro. alta concentracin celular.
 Clculo.
Es importante: Para calcular el factor de
dilucin basta con utilizar el nmero de
volmenes de la seccin (100 o 10) y dividirla
entre el volumen utilizado de muestra.
Cmara de Petroff-Hausser.
 Formula General

n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en
clulas/ml.
Contadores electrnicos (Counter-Coulter).
Sistema de medicin no ptico.

Consiste en una cmara divida en 2 compartimientos

conectados entre si por un orificio de 5 10 m de
dimetro con un medidor de resistencia elctrica.

Se basa en la deteccin de los pulsos elctricos

producidos por los microorganismo al pasar por dicho
orificio, ya que la bacteria altera la resistencia del medidor.

Por lo tanto: 1 pulso = 1 microorganismo.

Desventajas:
Se puede tapar el orificio.

No puede contar bacterias filamentosas.

Clulas muy grandes no se pueden leer.

Clulas muy pequeas no las cuenta.

En ocasiones si pasan 2 clulas juntas las cuenta como una

sola.
 El nmero mas probable.
Mtodo probabilstico, asume que las bacterias se encuentran
normalmente distribuidas en un liquido (homogneamente).

Por lo que muestras repetidas de mismo tamao de un mismo

producto deben contener el mismo nmero de microorganismos
como promedio.

La cifra media de microorganismos es el nmero ms probable.

 P. ej.

En una muestra que contiene 100 m.o./ 100 mL

Se toman alcuotas de: 10 mL, 1 mL y 0.1 mL

V1 = 10 mL Se esperan 10 m.o.

V2 = 1 mL Se espera 1 m.o.

V3 = 0.1 mL Puede que haya o no

m.o., la posibilidad de que
haya 1 m.o. es de 1:10

Nota: esta prueba se utiliza sobre todo para determinacin de

coliformes (bacilos Gram no esporulados fermentadores de
lactosa a 35 C) usando caldo rojo de fenol ms lactosa.
Se pueden usar 3 series de 5 tubos, o 5 de 3.

Siempre la primera serie se marca como [2x] por contener

doble concentracin.
Se emplea campana de Durham invertida.
Incubar a 37 C 24 48 h
 Se realiza la lectura, los tubos positivos
deben contener cido ms gas.

Para nuestro ejemplo:

V1 = 10 mL 4 (+)
Cotejar resultado en
V2 = 1 mL 2 (+) tablas de Mc Crady para
una seria de 15 tubos.
V3 = 0.1 mL 1 (+)
NMP = 26

Se reporta: NMP = 26 m.o./ mL

Para la prueba confirmativa se hace lo siguiente:
1. Realizar subcultivo a partir de un tubo (+) (tubo mas
diluido) en agar EMB por estra.
Para la prueba total:
2. Resembrar en un solo tubo de caldo rojo de fenol ms
lactosa, incubar 35 C (SE ESPERA PRUEBA +).
3. Resembrar en otro tubo, de AN en pico de flauta, incubar
35 C (SE ESPERAN BACILOS CORTOS GRAM - ).

Se pueden aplicar pruebas IMUiC (Indol (SIM o MIO), Rojo de metilo,

Voges-Proskauer, Citrato).

- La primer prueba solo me dice que hay coliformes, no la especie.

- La segunda determina fermentacin de lactosa.

IMUiC especifico para E. coli: (+) (+) ( - ) ( -)

 Referencias.
Jawetz E et al. Microbiologa mdica. Mxico D.F.: Ed. El Manual
Moderno, 1995.

Murray PR. Pocket Guide to Clinical Microbiology. 2a ed. USA:

American Society for Microbiology; 1998.

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCre
cimiento_19837.pdf

Tortora J. G., Funke R. B., Case L. C. Introduccin a la microbiologa.

9 Ed. Argentina: EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A. 2007.
Koneman W. E., Procop W. G., Woods L. G., et. al. Koneman.

Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas en color. 6 Ed. Argentina:

EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A. 2008.